Integrering av tarmorganoider hos hunder og et mikrofluidisk system fra Gut-on-a-Chip tilbyr relevante translasjonsmodeller for tarmsykdommer hos mennesker. Protokoller presentert tillater 3D-morfogenese og dynamisk in vitro-modellering av tarmen, og hjelper til med utvikling av effektive behandlinger for tarmsykdommer hos hunder og mennesker med One Health.
Hundens tarmer har likheter i anatomi, mikrobiologi og fysiologi til mennesker, og hunder utvikler naturlig spontane tarmsykdommer som ligner på mennesker. Å overvinne den iboende begrensningen av tredimensjonale (3D) organoider ved tilgang til den apikale overflaten av tarmepitelet har ført til generering av todimensjonale (2D) monolagskulturer, som eksponerer den tilgjengelige luminaloverflaten ved hjelp av celler avledet fra organoider. Integreringen av disse organoider og organoid-avledede monolagskulturer i et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system har videreutviklet teknologien, noe som muliggjør utvikling av mer fysiologisk relevant dynamisk in vitro tarmmodeller.
I denne studien presenterer vi en protokoll for generering av 3D-morfogenese av hundens tarmepitel ved bruk av primære intestinale vevsprøver hentet fra hunder som er rammet av inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Vi skisserer også en protokoll for generering og vedlikehold av 2D-monolagskulturer og tarm-på-en-brikke-systemer ved bruk av celler avledet fra 3D-intestinale organoider. Protokollene som presenteres i denne studien tjener som et grunnleggende rammeverk for å etablere et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system spesielt utviklet for hjørnetenner. Ved å legge grunnlaget for denne innovative tilnærmingen, tar vi sikte på å utvide anvendelsen av disse teknikkene i biomedisinsk og translasjonsforskning, i tråd med prinsippene i One Health Initiative. Ved å benytte denne tilnærmingen kan vi utvikle mer fysiologisk relevante dynamiske in vitro-modeller for å studere tarmfysiologi hos både hunder og mennesker. Dette har betydelige implikasjoner for biomedisinske og farmasøytiske applikasjoner, da det kan hjelpe til med å utvikle mer effektive behandlinger for tarmsykdommer i begge arter.
Intestinal epitelial morfogenese har i stor grad blitt studert gjennom laboratoriedyrmodeller, som er kostbare, tidkrevende og ikke nøyaktig representerer menneskelige utviklingsprosesser1. Videre mangler konvensjonelle statiske 2D-cellekulturmodeller muligheten til å etterligne den komplekse romlige organisasjonen til en 3D-epitelarkitektur2. Som et resultat er det behov for en protokoll for å indusere in vitro 3D-morfogenese ved bruk av tarmepitelceller fra menneskerelevante dyremodeller for å fremme vår forståelse av tarmepitelarkitektur.
Selskapshunder har utviklet tarmanatomi og mikrobiomsammensetninger som er bemerkelsesverdig lik mennesker på grunn av deres delte miljø og kosthold under domestisering3. I tillegg til denne likheten deler både mennesker og hunder ulike kroniske sykeligheter som antas å tilskrives tarmhelsen. Hunder, som mennesker, kan spontant utvikle kroniske tilstander som fedme, kognitiv dysfunksjon, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolorektalt adenokarsinom 4,5,6,7,8,9,10. Til tross for utvikling og bruk av humane og murine epitelceller i tidligere Gut-on-a-Chip-studier 2,11,12,13,14, har hundens tarmepitel ikke blitt brukt til nå. Vår nye tilnærming, som bruker hundens tarmorganoidepitel i et dynamisk kultursystem med en 3D-epitelial morfogenese, har betydelige implikasjoner for både hund og humanmedisin.
Nylige fremskritt i intestinal organoidkultur har ført til etablering av hundens intestinale organoidkultur15. Dette kultursystemet innebærer dyrking av intestinale stamceller under definert morfogenkondisjonering, noe som resulterer i en 3D-modell med selvfornyende egenskaper avledet fra voksne stamceller16. Imidlertid utgjør gjennomføring av transportanalyser eller vertsmikrobiom-kokulturer vanskeligheter med denne 3D-modellen på grunn av den lukkede naturen til tarmlumen17. For å løse dette har forskere generert et 2D-monolag avledet fra intestinale organoider, noe som muliggjør eksponering av luminaloverflaten18,19. Imidlertid opprettholdes både 3D-organoider og 2D-monolag under statiske forhold, som ikke nøyaktig reflekterer in vivo-biomekanikken i tarmmikromiljøet. Kombinere pasientavledede hundeorganoider teknologi med in vitro 3D morfogenese gir en mulighet for translasjonsforskning på kroniske multifaktorielle sykdommer. Denne tilnærmingen gjør det mulig for forskere å utvikle mer effektive behandlinger som gagner både mennesker og hunder og videre fremme translasjonsforskning, i tråd med One Health Initiative, som er en samarbeidstilnærming som anerkjenner sammenhengen mellom menneskers, dyrs og miljømessige helse. Det fremmer tverrfaglig samarbeid for å løse komplekse helseutfordringer og oppnå optimale helseutfall for alle. Ved å forstå den gjensidige avhengigheten mellom mennesker, dyr og økosystemer, tar initiativet sikte på å redusere risikoen fra nye smittsomme sykdommer, miljøforringelse og andre felles helseproblemer20,21,22.
Denne protokollen skisserer omfattende metoder for dyrking av tarmepitelceller fra hunder oppnådd fra pasientorganoider på en Gut-on-a-Chip-mikroenhet med en polydimetylsiloksan (PDMS) -basert porøs membran. Etablering av 3D-epitelial morfogenese ved å integrere hundens intestinale organoider og denne Gut-on-a-Chip-teknologien gjør det mulig for oss å studere hvordan tarmen utvikler og opprettholder sin cellulære organisasjon og stamcellenisje. Denne plattformen gir en verdifull mulighet til å undersøke virkningen av mikrobiomsamfunn på tarmhelsen og forstå hvordan disse samfunnene genererer mikrobielle metabolitter som bidrar til intestinal patofysiologi14,23. Disse fremskrittene kan nå utvides til hundens tarmprøver, noe som gir forskere muligheter til å utforske det intrikate forholdet mellom tarmmikrobiomet og vertsfysiologien. Dette åpner muligheter for å få verdifull innsikt i de underliggende mekanismene i tarmpatofysiologi og forstå den potensielle rollen til mikrobielle metabolitter i både hundens og menneskers helse, samt ulike sykdomsforhold. Protokollen som brukes til hundens Gut-on-a-Chip er reproduserbar, noe som gjør den til en egnet eksperimentell modell for komparativ medisin, da denne tilnærmingen muliggjør undersøkelse av vertsmikrobiominteraksjoner, patogeninfeksjoner og probiotisk-baserte terapeutiske effekter hos både hunder og mennesker.
Denne studien markerer den banebrytende demonstrasjonen av kompatibiliteten til hundens tarmorganoider med utviklingen av en hundens IBD Gut-on-a-Chip-modell. Integrasjonen av intestinale organoider og organoidavledede monolagskulturer i et mikrofluidisk system (dvs. Gut-on-a-Chip-system) har videreutviklet teknologien, noe som gjør det mulig å skape in vitro intestinale modeller som nøye etterligner fysiologisk dynamikk og er mer representative for biologiske forhold. Spesielt, siden det er svært få rapporter om Gut-on-a-Chip-kultur ved bruk av IBD-avledede organoider hos mennesker, kan den nåværende studien ved bruk av hundens IBD-avledede Gut-on-a-Chip gi ledende innsikt i studiet av IBD hos mennesker.
Den vellykkede utviklingen av hundens tarmepitelial 3D-morfogenese på en Gut-on-a-Chip krever nøye oppmerksomhet til flere kritiske trinn. For det første kan den hydrofobe overflaten til PDMS mikrofluidiske kanaler hindre ECM-adhesjon og påfølgende cellefeste, noe som nødvendiggjør overflateaktivering av PDMS før ECM-belegg og cellesåing (se protokollavsnitt 1). For å oppnå en stabil monolagskultur er fjerning av overflødige ikke-festede celler avgjørende etter cellevedlegg (protokolltrinn 4.6-4.7). I tillegg er dynamisk stimulering, som konstant mediumstrøm og peristaltisk-lignende vakuumbevegelse, nødvendig for 3D-morfogenese i tarmepitelet (protokolltrinn 5.2). Forsiktig håndtering er viktig for å unngå luftbobler i mikrokanalen under alle trinn i Gut-on-a-Chip-kulturen.
Hvis du støter på dårlig cellesåing i Gut-on-a-Chip, kan det skyldes lavt cellenummer eller dårlig cellefeste. For å feilsøke lave celletall, er det viktig å inspisere helsen til preparerte tarmorganoider ved å observere veksten i Matrigel. Cellens levedyktighet kan vurderes ved Trypan-blåfarging etter celledissosiasjon for å sikre at ikke mer enn 20% av cellene er døde. Hvis levedyktige celletall er utilstrekkelige, kan optimalisering av organoide mediumforhold forsøkes. En annen mulighet er ufullstendig organoid dissosiasjon, noe som resulterer i et overskudd av celleklumper større enn 70 μm som blir fanget av filteret. For å løse dette er ett alternativ å forlenge varigheten av pipettering under celledissosiasjon. Alternativt kan det koniske røret på 15 ml omrøres forsiktig hvert minutt mens det behandles med en trypsinlignende protease. Dårlig cellefeste til Gut-on-a-Chip kan skyldes feil ECM-belegg. Under belegningsprosessen anbefales det å nøye kontrollere tilstedeværelsen av luftbobler og forhindre dannelse av dem ved forsiktig å legge til mer beleggløsning etter behov. Overbefolkning av celler og manglende evne til å vaske bort ufestede celler kan resultere i et utilstrekkelig innledende monolayer. I et slikt tilfelle kan en mild pulserende påføres når du skyver sprøytestempelet. Disse feilsøkingstrinnene kan bidra til å identifisere og løse problemer under Gut-on-a-Chip-kulturprosessen.
Mens denne Gut-on-a-Chip-plattformen muliggjør opprettelse av bølgete 3D-epitellag, anerkjenner vi behovet for ytterligere biologisk kompleksitet for å replikere tarmmikromiljøet fullt ut. Det er avgjørende å vurdere samspillet mellom epitel- og mesenkymale celler, avsetning av ECM for 3D-regenerering og tilstedeværelsen av krypt-villus-egenskaper som etablerer en egnet stamcellenisje. Stromale celler, som fibroblaster, spiller en viktig rolle i produksjonen av ECM-proteiner og reguleringen av intestinal morfogenese34,35,36. Inkludering av mesenkymale celler i denne modellen har potensial til å forbedre både morfogenese og effektiviteten av cellevedlegg. Endotellag, som omfatter kapillærvaskulatur og lymfekar, spiller en avgjørende rolle for å styre molekylær transport og rekruttering av immunceller37,38. Inkludering av pasientavledede immunceller kan være avgjørende for modellering av tarmsykdommer, da det muliggjør demonstrasjon av samspillet mellom medfødt og adaptiv immunitet, samt etablering av vevsspesifikk immunitet39. Etter fullføring av 3D-morfogenese på Gut-on-a-Chip, kan organoidkulturmediet modifiseres til et organoid differensieringsmedium. Dette kan være en levedyktig tilnærming for å indusere ytterligere cellulær differensiering, avhengig av eksperimentelle mål.
Avbildning av 3D-mikroarkitekturen in situ er utfordrende på grunn av den lange arbeidsavstanden som kreves, som kan overvinnes med et langdistansemål. I tillegg gjør lag-for-lag mikrofabrikasjons- og bindingsmetodene det vanskelig å få tilgang til øvre lag for undersøkelse med SEM. For den nåværende Gut-on-a-Chip-designen er det nødvendig med en sprøytepumpe per Gut-on-a-Chip-mikroenhet, som opptar CO2 -inkubatorplass og forhindrer store eksperimenter. Innovasjoner er nødvendig for å øke skalerbarheten for en brukervennlig plattform og screening med høy gjennomstrømning.
Disse nåværende protokollene tillater spontan utvikling av 3D-epitellag in vitro, og overgår begrensningene til tradisjonelle 3D-organoider, 2D-monolag og statiske mikroenhetskultursystemer. Dette dynamiske in vitro intestinale mikromiljøet kan styres ved å introdusere samkultur av forskjellige celletyper. Tidligere studier har utforsket metoder for å manipulere Gut-on-a-Chip-mikromiljøet, inkludert co-dyrking av intestinal mikrobiom14,23 og perifere mononukleære celler30. Dette rekonstituerte mikromiljøet har mange potensielle anvendelser, inkludert narkotikatesting, grunnleggende mekanistiske studier og sykdomsmodellering. Det rekonstruerte mikromiljøet har betydelig potensial for et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel narkotikatesting 23,40,41 og sykdomsmodellering 12,13,14,30, samt grunnleggende mekanistiske undersøkelser av intestinal morfogenese 42. En rekke analyser kan utføres ved enten å samle supernatanter for vurdering av metabolitter 43, ved å samle celler for genomisk undersøkelse 2,32, eller ved å visuelt undersøke cellene ved hjelp av levende cellefarger eller fiksering for påfølgende immunfluorescensavbildning 23,44.
Denne studien presenterer en reproduserbar protokoll for å utvikle 3D-morfogenese av hundens tarmepitellag i en Gut-on-a-Chip-plattform. Den resulterende 3D-epitelstrukturen gir en mer realistisk representasjon av tarmmikromiljøet, som har et enormt potensial for anvendelser i ulike biomedisinske studier. Ved å utnytte denne tarmarkitekturen kan vi utføre mer translasjonsforskning og potensielt gi lovende resultater.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke WSU Small Animal Internal Medicine-tjenesten (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) og WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss for deres støtte i saksrekruttering og prøveinnsamling fra borgerforskere (pasientdonorer). Dette arbeidet ble støttet delvis av kontoret til direktøren, National Institutes of Health (K01OD030515 og R21OD031903 til YMA) og Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 til I.N.). Figur 1A og figur 3A ble laget med BioRender.com.
Organoid basal medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
Organoids and organoid medium | |||
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
[Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Reagents | |||
4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
Materials and Equipment | |||
24-well culture plates | Corning | 3524 | |
87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica microsystems |