Integrering av hundens tarmorganoider och ett Gut-on-a-Chip mikrofluidiksystem erbjuder relevanta translationella modeller för mänskliga tarmsjukdomar. Protokoll som presenteras möjliggör 3D-morfogenes och dynamisk in vitro-modellering av tarmen, vilket bidrar till utvecklingen av effektiva behandlingar för tarmsjukdomar hos hundar och människor med One Health.
Hundtarmar har likheter i anatomi, mikrobiologi och fysiologi med människors, och hundar utvecklar naturligt spontana tarmstörningar som liknar människors. Att övervinna den inneboende begränsningen av tredimensionella (3D) organoider när det gäller att komma åt den apikala ytan av tarmepitelet har lett till generering av tvådimensionella (2D) monolagerkulturer, som exponerar den tillgängliga luminala ytan med hjälp av celler som härrör från organoiderna. Integreringen av dessa organoider och organoid-härledda monolagerkulturer i ett mikrofluidiskt Gut-on-a-Chip-system har vidareutvecklat tekniken, vilket möjliggör utveckling av mer fysiologiskt relevanta dynamiska in vitro-tarmmodeller .
I denna studie presenterar vi ett protokoll för att generera 3D-morfogenes av hundens tarmepitel med hjälp av primära tarmvävnadsprover erhållna från hundar som drabbats av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). Vi beskriver också ett protokoll för att generera och underhålla 2D-monolagerkulturer och intestine-on-a-chip-system med hjälp av celler som härrör från 3D-tarmorganoiderna. Protokollen som presenteras i denna studie fungerar som ett grundläggande ramverk för att etablera ett mikrofluidiskt Gut-on-a-Chip-system speciellt utformat för hundar. Genom att lägga grunden för detta innovativa tillvägagångssätt strävar vi efter att utöka tillämpningen av dessa tekniker inom biomedicinsk och translationell forskning, i linje med principerna för One Health-initiativet. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan vi utveckla mer fysiologiskt relevanta dynamiska in vitro-modeller för att studera tarmfysiologi hos både hund och människa. Detta har betydande konsekvenser för biomedicinska och farmaceutiska tillämpningar, eftersom det kan bidra till utvecklingen av effektivare behandlingar för tarmsjukdomar hos båda arterna.
Intestinal epitelial morfogenes har till stor del studerats genom försöksdjursmodeller, som är kostsamma, tidskrävande och inte korrekt representerar mänskliga utvecklingsprocesser1. Dessutom saknar konventionella statiska 2D-cellodlingsmodeller förmågan att efterlikna den komplexa rumsliga organisationen av en 3D-epitelarkitektur2. Som ett resultat finns det ett behov av ett protokoll för att inducera in vitro 3D-morfogenes med hjälp av tarmepitelceller från humana relevanta djurmodeller för att öka vår förståelse av tarmepitelarkitekturen.
Sällskapshundar har utvecklat tarmanatomi och mikrobiomsammansättningar som är anmärkningsvärt lika människor på grund av deras gemensamma miljö och kost under domesticeringen3. Utöver denna likhet delar både människor och hundar olika kroniska sjukdomar som tros tillskrivas tarmhälsan. Hundar, precis som människor, kan spontant utveckla kroniska tillstånd som fetma, kognitiv dysfunktion, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och kolorektal adenocarcinom 4,5,6,7,8,9,10. Trots utveckling och användning av humana och murina epitelceller i tidigare Gut-on-a-Chip-studier 2,11,12,13,14, har hundens tarmepitel inte använts förrän nu. Vårt nya tillvägagångssätt, att använda hundtarmorganoidepitel i ett dynamiskt odlingssystem med en 3D-epitelmorfogenes, har betydande konsekvenser för både hund- och humanmedicin.
De senaste framstegen inom tarmorganoidkultur har lett till etableringen av tarmorganoidkulturför hundar 15. Detta odlingssystem innebär att man odlar stamceller från tarmen under definierad morfogenbetingning, vilket resulterar i en 3D-modell med självförnyande egenskaper som härrör från adulta stamceller16. Att genomföra transportanalyser eller värd-mikrobiom-samkulturer innebär dock svårigheter med denna 3D-modell på grund av den slutna karaktären hos tarmlumen17. För att ta itu med detta har forskare genererat ett 2D-monolager härlett från tarmorganoider, vilket möjliggör exponering av den luminala ytan18,19. Både 3D-organoider och 2D-monolager bibehålls dock under statiska förhållanden, vilket inte korrekt återspeglar biomekaniken in vivo i tarmmikromiljön. Att kombinera patientbaserad hundorganoidteknik med in vitro 3D-morfogenes ger en möjlighet till translationell forskning om kroniska multifaktoriella sjukdomar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att utveckla effektivare behandlingar som gynnar både människor och hundar och ytterligare främja translationell forskning, i linje med One Health-initiativet, som är en samarbetsstrategi som erkänner sambandet mellan människors, djurs och miljöns hälsa. Det främjar tvärvetenskapligt samarbete för att ta itu med komplexa hälsoutmaningar och uppnå optimala hälsoresultat för alla. Genom att förstå det ömsesidiga beroendet mellan människor, djur och ekosystem syftar initiativet till att minska riskerna från nya infektionssjukdomar, miljöförstöring och andra gemensamma hälsoproblem20,21,22.
Detta protokoll beskriver omfattande metoder för odling av hundtarmepitelceller erhållna från patientorganoider på en Gut-on-a-Chip-mikroenhet med ett polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat poröst membran. Genom att etablera 3D-epitelmorfogenesen genom att integrera hundens tarmorganoider och denna Gut-on-a-Chip-teknik kan vi studera hur tarmen utvecklas och upprätthåller sin cellulära organisation och stamcellsnisch. Denna plattform erbjuder en värdefull möjlighet att undersöka mikrobiomsamhällenas inverkan på tarmhälsan och förstå hur dessa samhällen genererar mikrobiella metaboliter som bidrar till tarmpatofysiologi14,23. Dessa framsteg kan nu utvidgas till hundtarmprover, vilket ger forskare möjligheter att utforska det intrikata förhållandet mellan tarmmikrobiomet och värdens fysiologi. Detta öppnar vägar för att få värdefulla insikter i de underliggande mekanismerna för tarmpatofysiologi och förstå den potentiella rollen för mikrobiella metaboliter i både hundens och människors hälsa, såväl som olika sjukdomstillstånd. Protokollet som används för hundens Gut-on-a-Chip är reproducerbart, vilket gör det till en lämplig experimentell modell för komparativ medicin, eftersom detta tillvägagångssätt möjliggör undersökning av värd-mikrobiominteraktioner, patogeninfektioner och probiotikabaserade terapeutiska effekter hos både hundar och människor.
Denna studie markerar den banbrytande demonstrationen av kompatibiliteten hos hundens tarmorganoider med utvecklingen av en IBD Gut-on-a-Chip-modell för hundar. Integreringen av tarmorganoider och organoid-härledda monolagerkulturer i ett mikrofluidiskt system (dvs. Gut-on-a-Chip-system) har vidareutvecklat tekniken, vilket möjliggör skapandet av in vitro-tarmmodeller som nära efterliknar fysiologisk dynamik och är mer representativa för biologiska förhållanden. I synnerhet, eftersom det finns mycket få rapporter om Gut-on-a-Chip-kultur med IBD-härledda organoider hos människor, kan den aktuella studien med IBD-härledd Gut-on-a-Chip från hundar ge ledande insikter i studien av IBD hos människor.
Den framgångsrika utvecklingen av hundens tarmepitel 3D-morfogenes på ett Gut-on-a-Chip kräver noggrann uppmärksamhet på flera kritiska steg. För det första kan den hydrofoba ytan på PDMS-mikrofluidikkanaler hindra ECM-vidhäftning och efterföljande cellbindning, vilket kräver ytaktivering av PDMS före ECM-beläggning och cellsådd (se protokollavsnitt 1). För att uppnå en stabil monolagerodling är det viktigt att avlägsna överflödiga celler som inte är bundna efter cellbindning (protokollsteg 4.6-4.7). Dessutom är dynamisk stimulering, såsom konstant medieflöde och peristaltisk vakuumrörelse, nödvändig för 3D-morfogenes av tarmepitelet (protokollsteg 5.2). Noggrann hantering är avgörande för att undvika luftbubblor i mikrokanalen under alla steg i Gut-on-a-Chip-kulturen.
Om du stöter på dålig cellsådd i Gut-on-a-Chip kan det bero på ett lågt cellantal eller dålig cellfäste. För att felsöka lågt cellantal är det viktigt att inspektera hälsan hos beredda tarmorganoider genom att observera deras tillväxt i Matrigel. Cellviabiliteten kan bedömas genom Trypan-blåfärgning efter celldissociation för att säkerställa att inte mer än 20 % av cellerna är döda. Om antalet livskraftiga celler är otillräckligt kan man försöka optimera organoidmedieförhållandena. En annan möjlighet är ofullständig organoiddissociation, vilket resulterar i ett överskott av cellklumpar större än 70 μm som fångas av filtret. För att lösa detta är ett alternativ att förlänga pipetteringstiden under celldissociation. Alternativt kan den 15 ml koniska slangen försiktigt röras varje minut medan den behandlas med ett trypsinliknande proteas. Dålig cellfäste till Gut-on-a-Chip kan bero på felaktig ECM-beläggning. Under beläggningsprocessen rekommenderas det att noggrant kontrollera om det finns luftbubblor och förhindra att de bildas genom att försiktigt tillsätta mer beläggningslösning efter behov. Överbeläggning av celler och underlåtenhet att tvätta bort obundna celler kan resultera i ett otillräckligt initialt monolager. I ett sådant fall kan en mild pulsering appliceras när du trycker på sprutkolven. Dessa felsökningssteg kan hjälpa dig att identifiera och åtgärda problem under Gut-on-a-Chip-odlingsprocessen.
Även om denna Gut-on-a-Chip-plattform gör det möjligt att skapa böljande 3D-epitellager, inser vi behovet av ytterligare biologisk komplexitet för att replikera tarmmikromiljön fullt ut. Det är viktigt att ta hänsyn till interaktionerna mellan epitelceller och mesenkymala celler, deponeringen av ECM för 3D-regenerering och förekomsten av kryptvillusegenskaper som etablerar en lämplig stamcellsnisch. Stromaceller, såsom fibroblaster, spelar en viktig roll i produktionen av ECM-proteiner och regleringen av tarmmorfogenesen34,35,36. Inkluderingen av mesenkymala celler i denna modell har potential att förbättra både morfogenesen och effektiviteten av cellbindning. Endotellager, som omfattar kapillärkärl och lymfkärl, spelar en avgörande roll för att styra molekylär transport och rekrytering av immunceller37,38. Inkludering av immunceller från patienter kan vara avgörande för modellering av tarmsjukdomar eftersom det gör det möjligt att demonstrera samspelet mellan medfödd och adaptiv immunitet samt att etablera vävnadsspecifik immunitet39. Efter slutförandet av 3D-morfogenesen på Gut-on-a-Chip kan organoidodlingsmediet modifieras till ett organoiddifferentieringsmedium. Detta kan vara ett genomförbart tillvägagångssätt för att inducera ytterligare cellulär differentiering, beroende på de experimentella målen.
Att avbilda 3D-mikroarkitekturen på plats är utmanande på grund av det långa arbetsavstånd som krävs, vilket kan övervinnas med ett långdistansobjektiv. Dessutom gör lager-för-lager-mikrofabrikationen och bindningsmetoderna det svårt att komma åt de övre lagren för undersökning med SEM. För den nuvarande Gut-on-a-Chip-designen behövs en sprutpump per Gut-on-a-Chip-mikroenhet, vilket upptar CO2 -inkubatorns utrymme och förhindrar storskaliga experiment. Innovationer behövs för att öka skalbarheten för en användarvänlig plattform och screening med hög genomströmning.
Dessa nuvarande protokoll möjliggör spontan utveckling av 3D-epitelskikt in vitro, vilket överträffar begränsningarna hos traditionella 3D-organoider, 2D-monolager och statiska mikroenhetsodlingssystem. Denna dynamiska in vitro-mikromiljö i tarmen kan kontrolleras genom att introducera samodling av olika celltyper. Tidigare studier har undersökt metoder för att manipulera Gut-on-a-Chip-mikromiljön, inklusive samodling av tarmmikrobiom14,23 och perifera mononukleära celler30. Denna rekonstruerade mikromiljö har många potentiella tillämpningar, inklusive drogtester, grundläggande mekanistiska studier och sjukdomsmodellering. Den rekonstruerade mikromiljön har betydande potential för ett brett spektrum av tillämpningar, såsom läkemedelstestning 23,40,41 och sjukdomsmodellering 12,13,14,30, samt grundläggande mekanistiska undersökningar av tarmmorfogenes 42. En mängd olika analyser kan utföras antingen genom att samla in supernatanter för bedömning av metaboliter 43, genom att samla in celler för genomisk undersökning 2,32, eller genom att visuellt undersöka cellerna med hjälp av levande cellfärgämnen eller fixering för efterföljande immunofluorescensavbildning 23,44.
Denna studie presenterar ett reproducerbart protokoll för att utveckla 3D-morfogenes av hundens tarmepitellager i en Gut-on-a-Chip-plattform. Den resulterande 3D-epitelstrukturen ger en mer realistisk representation av tarmmikromiljön, vilket har en enorm potential för tillämpningar i olika biomedicinska studier. Genom att använda denna tarmarkitektur kan vi bedriva mer translationell forskning och potentiellt ge lovande resultat.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka WSU Small Animal Internal Medicine Service (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) och WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss för deras stöd vid fallrekrytering och provtagning från medborgarforskare (patientdonatorer). Detta arbete stöddes delvis av Office of The Director, National Institutes Of Health (K01OD030515 och R21OD031903 till Y.M.A.) och Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 till I.N.). Figur 1A och figur 3A skapades med BioRender.com.
Organoid basal medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
Organoids and organoid medium | |||
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
[Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Reagents | |||
4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
Materials and Equipment | |||
24-well culture plates | Corning | 3524 | |
87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica microsystems |