Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos
Summary
Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.
Abstract
As células-tronco mesenquimais (CTMs) de um organismo possuem uma extraordinária capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens de células adultas no corpo e são conhecidas por suas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias. O uso dessas células-tronco é um benefício para o campo da biologia regenerativa, mas, ao mesmo tempo, uma desgraça para a medicina regenerativa e terapêutica devido às múltiplas ambiguidades celulares associadas a elas. Essas ambiguidades podem decorrer da diversidade na fonte dessas células-tronco e de suas condições de crescimento in vitro , que refletem em sua heterogeneidade funcional.
Isso justifica metodologias para fornecer populações purificadas e homogêneas de CTMs para aplicações terapêuticas. Avanços no campo da citometria de fluxo têm possibilitado a detecção de populações unicelulares utilizando uma abordagem multiparamétrica. Este protocolo descreve uma maneira de identificar e purificar células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) por meio da classificação unicelular assistida por fluorescência. A expressão simultânea de marcadores de superfície, a saber, CD90-fluoresceína isotiocianato (FITC), CD73-peridinina-clorofila-proteína (PerCP-Cy5.5), CD105-aloficocianina (APC) e CD44-V450, identificou os “brilhantes”, expressores positivos de CTMs usando citometria de fluxo multiparamétrica. No entanto, observou-se uma queda significativa nas porcentagens de quatro expressores desses marcadores positivos a partir da passagem 7 para as passagens posteriores.
As subpopulações imunofenotipadas foram classificadas pelo modo de classificação unicelular, onde apenas dois marcadores positivos e um negativo constituíram os critérios de inclusão. Esta metodologia garantiu a viabilidade celular das populações selecionadas e manteve a proliferação celular após a triagem. A aplicação a jusante para tal classificação pode ser usada para avaliar a diferenciação linhagem específica para as subpopulações fechadas. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de célula única para melhorar as condições de isolamento e para adquirir informações de múltiplos marcadores de superfície celular.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem ser consideradas uma fonte escalável de células adequadas para terapias baseadas em células e podem ser consideradas um sistema padrão-ouro na medicina regenerativa. Essas células podem ser isoladas de uma variedade de fontes no organismo com diferentes origens teciduais1. Dependendo do tecido fonte, cada tipo de CTM apresenta comportamento in vitro ambíguo2. Isso é bem observado em suas propriedades morfológicas efuncionais3. Múltiplos estudos têm demonstrado variação intraclonal nas dimensões, incluindo diferenciação tecidual do adulto, estado genômico e arquitetura metabólica e celular dasCTMs 2,4.
A imunofenotipagem de células tem sido uma aplicação comum da citometria de fluxo para a identificação de células-tronco e foi utilizada pela Sociedade Internacional de Terapia Celular e Gênica (ISCT) em 2006 para prescrever uma lista de critérios mínimos para identificar células como CTMs. Afirmou que, juntamente com a aderência plástica e a capacidade de diferenciação in vitro em três linhagens (osteogênica, condrogênica e adipogênica), ≥95% da população celular deve expressar CD105, CD73, CD90, e essas células não devem ter a expressão (≤2% positiva) de CD34, CD45, CD11b, CD14 e HLA-DR, medida por citometria de fluxo5. Embora as CTMs tenham sido definidas por um conjunto de biomarcadores sob os critérios mínimos do ISCT, suas propriedades imunológicas não puderam ser comparadas com esses biomarcadores e houve uma necessidade de mais além desses critérios para tornar as comparações entre estudos e variações clonais mais fáceis de quantificar2.
Apesar das diretrizes estabelecidas pelo ISCT, uma extensa pesquisa sobre CTMs tem mostrado que existe heterogeneidade nessa população, que pode surgir devido a uma infinidade de fatores, principalmente devido à natureza ubíqua da heterogeneidade que surge entre doadores de CTM6, fontes de tecido7, células individuais dentro de uma população clonal8 e condições de cultura2,9, 10º. A caracterização e purificação dessas células primárias a partir de uma variedade de fontes de tecido para garantir a qualidade e o destino celular são etapas fundamentais em sua produção. A necessidade de compreender as variações apresentadas entre a população requer um método eficiente para resolvê-las em subpopulações que podem ser divididas e coletadas separadamente11. Análises em nível de célula única ajudam a superar os desafios da variação célula-célula, reduzem o ruído biológico proveniente de uma população heterogênea e oferecem a capacidade de investigar e caracterizar células raras12.
Com base na finalidade e nos parâmetros escolhidos, vários métodos podem ser empregados para classificar e enriquecer as populações selecionadas. As técnicas de classificação de células podem incluir métodos de classificação em massa e de célula única. Enquanto a triagem em massa pode enriquecer populações-alvo por meio da classificação celular ativada por fluorescência (MACS)13, fracionamento14 e elutriação 15, a triagem de células únicas pode enriquecer populações mais homogêneas por meio da classificação celular ativada por fluorescência (FACS)11. Uma análise comparativa de cada um desses métodos com seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens é destacada na Tabela 1.
Tabela 1: Análises comparativas de diferentes técnicas: MACS, Fracionamento, Elutriação e FACS, destacando as diferenças em seu princípio e as vantagens e desvantagens da escolha de uma determinada técnica em detrimento de outra. Abreviações: MACS = Magnetic-activated cell sorting; FACS = Classificação celular ativada por fluorescência. Clique aqui para baixar esta tabela.
Desde o advento da técnica, a citometria de fluxo unicelular tem desempenhado um papel importante naenumeração16, detecção e caracterização de uma população celular específica em uma amostra heterogênea17. Hewitt et al., em 2006, lançaram as bases da metodologia de classificação celular automatizada para melhorar o isolamento de pools homogêneos de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas (hESCs)18. A triagem unicelular enriqueceu a população de hESCs transduzidas por GFP, facilitando o isolamento de clones geneticamente modificados, o que abriu uma nova dimensão na pesquisa clínica. Para melhorar a eficiência da classificação, duas abordagens foram geralmente adotadas; Ou os meios de coleta das populações triadas são modificados para sustentar a viabilidade e proliferação de células pós-trificadas19 ou o algoritmo/software de classificação celular é modificado adequadamente12.
Com o avanço da tecnologia, citômetros de fluxo comerciais e classificadores de células foram capazes de ajudar a enfrentar desafios que foram enfrentados ao classificar assepticamente populações de células frágeis e raras, especialmente células-tronco de diferentes origens. Um dos grandes desafios dos biólogos de células-tronco tem sido o isolamento clonal de células-tronco pluripotentes humanas seguindo protocolos de transfecção exigidos em estudos de edição gênica19. Isso foi resolvido classificando células únicas em placas de 96 poços que foram revestidas com fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), juntamente com suplementos e inibidores comerciais de pequenas moléculas de ROCK. No entanto, as estratégias de isolamento celular poderiam ser amplamente refinadas com o uso da classificação por índice, uma característica do algoritmo de classificação que identifica o imunofenótipo de células individuais classificadas12. Essa modalidade refinada na classificação de células únicas ajudou não apenas a aumentar a eficiência da classificação de células-tronco, especialmente no que diz respeito a populações raras de células-tronco hematopoéticas, mas também ligou eficientemente clones de célula única a seus ensaios funcionais a jusante20.
Este artigo enfoca a triagem unicelular de células-tronco imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) para o enriquecimento de subpopulações para estudar suas capacidades de diferenciação funcional. Utilizando a combinação de dois marcadores CTM positivos, CD90 e CD73, e um marcador hematopoiético negativo CD45, as CTMs foram imunofenotipadas e os expressores dim e null foram identificados. Com base em seu imunofenótipo, as subpopulações foram identificadas como CTMs puras, populações positivas simples e duplas negativas. Eles foram classificados usando o modo de classificação unicelular para obter subpopulações puras e enriquecidas para estudos funcionais posteriores para identificar se a expressão diferencial de marcadores era um artefato de condições de cultivo in vitro ou se também tem algum efeito sobre as propriedades funcionais. As células que não eram expressores homogêneos dos “marcadores MSC positivos” foram selecionadas para estudar suas propriedades funcionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
No campo da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa, entre as fontes pós-natais, as CTMs derivadas de tecidos orais têm atraído profundo interesse devido às suas obrigações éticas mínimas e notável potencial de diferenciação de multilinhagens21. As células-tronco da polpa dentária (CTSAP) do terceiro molar impactado e dos SHEDs têm atraído a maior atenção entre as CTMs dentárias por seu potencial terapêutico em doenças neurodegenerativas e traum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Flow Cell Facility no Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Índia, pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. A criossecção da cultura de pellets de células diferenciadas foi realizada no Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Índia. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento intramuros da UC da Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Índia. A AG agradece o apoio da Bolsa Dr. T. M. A. Pai do MAHE.
Materials
| Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | — | |
| BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
| BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
| BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
| BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
| Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
| Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
| Ethanol | — | — | Used for general sterlization. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
| Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
| Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
| Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
| Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
| Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 – 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| Staining buffer | Prepared in MIRM | —- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
| StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
| StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
| StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
| Trypsin – EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
| Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
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