Monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione
Summary
Presentiamo un metodo per lo studio della ridisseminazione delle cellule tumorali da metastasi polmonari che prevede un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, seguito dall’identificazione di cellule tumorali ridisseminate negli organi terziari.
Abstract
Le metastasi – la diffusione sistemica del cancro – sono la principale causa di decessi correlati al cancro. Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule del tumore primario si disseminano e seminano metastasi, le cellule tumorali nelle metastasi esistenti possono anche ridisseminarsi e dare origine a nuove lesioni nei siti terziari in un processo noto come “metastasi da metastasi” o “semina da metastasi a metastasi”. La semina da metastasi a metastasi può aumentare il carico metastatico e diminuire la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base di questo fenomeno è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con cancro metastatico.
Poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sulla semina da metastasi a metastasi si basano principalmente su metodi di sequenziamento, che potrebbero non essere pratici per i ricercatori che studiano l’esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi o ciò che li promuove o li previene. Ciò evidenzia la mancanza di metodologie che facilitino lo studio del seeding da metastasi a metastasi. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato – e descriviamo qui – un protocollo chirurgico murino per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, consentendo la marcatura specifica e il monitoraggio del destino delle cellule tumorali che si ridisseminano dal polmone ai siti terziari. Per quanto ne sappiamo, questo è l’unico metodo per studiare la ridisseminazione delle cellule tumorali e la semina da metastasi a metastasi dai polmoni che non richiede l’analisi genomica.
Introduction
Le metastasi sono la principale causa di decessi correlati al cancro1. Il cancro metastatico insorge quando le cellule del tumore primario si diffondono in tutto il corpo e proliferano in tumori clinicamente rilevabili in organi distanti 2,3.
Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule tumorali si disseminano dal tumore primario e colonizzano organidistanti, l’aumento delle evidenze cliniche e sperimentali suggerisce che è in gioco un processo più complesso e multidirezionale. È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti possono riseminare il tumore primario (se ancora in sede)5,6,7,8,9 e le cellule tumorali provenienti da focolai metastatici esistenti possono viaggiare verso i siti terziari e dare origine a nuove lesioni 10,11,12,13. In effetti, l’evidenza di recenti analisi genomiche suggerisce che alcune lesioni metastatiche non derivano dal tumore primario, ma da altre metastasi, un fenomeno noto come “metastasi da metastasi” o “semina da metastasi a metastasi”14,15,16. La semina da metastasi a metastasi può perpetuare il processo patologico anche dopo la rimozione del tumore primario, aumentando il carico metastatico e diminuendo la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base della semina da metastasi a metastasi è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con malattia metastatica.
Nonostante le implicazioni cliniche potenzialmente gravi, poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sull’uomo sono limitati dalla scarsità di campioni clinici. La resezione clinica e la biopsia delle lesioni metastatiche sono rare, così come la biopsia di organi apparentemente sani, dove possono annidarsi singole cellule tumorali disseminate. Ciò significa che gli studi sull’uomo sono in genere possibili solo utilizzando campioni autoptici di individui i cui tumori primari sono ancora in atto o sono stati precedentemente resecati ma sono ancora disponibili per i ricercatori. Quando tali campioni sono disponibili, le analisi del lignaggio della progressione del cancro devono essere eseguite utilizzando metodi di sequenziamento14. Tuttavia, il sequenziamento di massa di tumori primari e metastasi abbinati non ha la sensibilità necessaria per un tracciamento completo del lignaggio. Ad esempio, il sequenziamento di massa di una lesione può rivelare un subclone che non è rilevabile in nessuna delle sue lesioni corrispondenti. In questo caso, non si sarebbe in grado di determinare l’origine di questo subclone. Può essere stata presente nel tumore primitivo o in un’altra metastasi con una frequenza inferiore al limite di rilevamento, oppure può essere insorta dopo la colonizzazione iniziale della lesione metastatica in cui è stata trovata. Il sequenziamento a singola cellula fornisce una maggiore sensibilità, ma il suo costo elevato limita l’applicazione su larga scala di questa tecnica. La natura retrospettiva di questi studi significa anche che forniscono una visione limitata degli eventi metastatici transitori e del panorama della malattia in diversi punti temporali.
Nei modelli animali, i recenti progressi tecnologici consentono ora una mappatura filogenetica prospettica con un’elevata risoluzione spaziale e temporale 17,18,19,20. Queste tecniche utilizzano l’editing del genoma CRISPR/Cas9 per ingegnerizzare le cellule con un codice a barre in evoluzione, mutazioni ereditabili che si accumulano nel tempo. Al momento del sequenziamento, il lignaggio di ciascuna cellula può essere tracciato in base al profilo mutazionale del suo codice a barre 17,18,19,20. In effetti, tale tecnologia viene già utilizzata per mappare la semina da metastasi a metastasi. In un recente articolo, Zhang et al. hanno dimostrato che le cellule tumorali della mammella e della prostata nelle metastasi ossee si ridisseminano dall’osso per seminare metastasi secondarie in più organi21.
Sebbene questi nuovi metodi abbiano un grande potenziale per generare mappe filogenetiche dettagliate e ad alta risoluzione della progressione del cancro, sono altamente impraticabili per coloro che studiano l’esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi e ciò che li promuove o li previene. Colmare queste lacune di conoscenza è fondamentale per perfezionare la nostra comprensione e il trattamento del cancro metastatico, ma c’è una notevole mancanza di tecnologie per facilitare tali studi. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato – e presentiamo qui – una nuova tecnica che ci consente di marcare in modo specifico le cellule tumorali tramite fotoconversione in un sito metastatico (il polmone) e successivamente reidentificarle negli organi terziari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo recentemente dimostrato che le cellule del cancro al seno si ridisseminano dalle metastasi polmonari e seminano gli organi terziari13. Questa tecnica può anche essere utilizzata per determinare la tempistica degli eventi di ridisseminazione all’interno di una finestra ristretta e quantificare le cellule tumorali disseminate, facilitando lo studio dell’organotropismo delle cellule disseminate e di ciò che promuove/previene la ridisseminazione.
Mentre la fotoconversione e i sistemi cre/lox localmente inducibili che sostituiscono permanentemente una proteina fluorescente con un’altra sono stati precedentemente utilizzati per marcare e tracciare le cellule tumorali 11,22,23, per quanto ne sappiamo, nessun approccio per la marcatura spazio-temporale delle cellule tumorali è stato ottimizzato per colpire il polmone – uno dei siti più comuni di metastasi tra uomini e donne a cui è stato diagnosticato uno dei 14 tumori più comuni 24. Qualsiasi tipo di cellula tumorale e qualsiasi protocollo per la generazione di metastasi polmonari può essere utilizzato con la nostra procedura, rendendola ampiamente utile per i ricercatori di metastasi. Tutte le cellule tumorali utilizzate per generare metastasi polmonari dovrebbero esprimere una proteina fotoconvertibile o fotocommutabile e i ricercatori possono scegliere quale proteina utilizzare in base alle loro esigenze e risorse specifiche. In questo studio, abbiamo utilizzato cellule di carcinoma mammario 6DT1 che esprimevano stabilmente la proteina fluorescente fotoconvertibile da verde a rosso Dendra2 (cellule 6DT1-Dendra2)25 marcata con l’istone H2B. Abbiamo iniettato 5,0 ×10 4 cellule 6DT1-Dendra2 nel quarto cuscinetto adiposo mammario di topi femmina Rag2-/-. I tumori primari erano palpabili tra 12 e 16 giorni dopo l’iniezione e non sono stati resecati per tutta la durata dell’esperimento. Le metastasi polmonari spontanee si sono sviluppate tra 19 e 26 giorni dopo l’iniezione di cellule tumorali. Gli interventi chirurgici di fotoconversione sono stati eseguiti tra 26 e 29 giorni dopo l’iniezione di cellule tumorali. I topi sono stati sacrificati entro 72 ore dall’intervento chirurgico a causa del carico di metastasi polmonari.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, descriviamo un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle cellule tumorali nel polmone. Questa tecnica consente ai ricercatori di contrassegnare selettivamente le cellule tumorali nel polmone e di monitorarne il destino reidentificandole in tutto il corpo in un secondo momento, facilitando lo studio delle metastasi da metastasi polmonari. Utilizzando questo protocollo, è stato possibile visualizzare le cellule fotoconvertite nel cervello, nel fegato e nel polmone destro non fotoconv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Wade Koba per la sua assistenza con la micro tomografia computerizzata (S10RR029545), Vera DesMarais e Hillary Guzik dell’Analytical Imaging Facility per la loro formazione e assistenza con la microscopia, l’Einstein Montefiore Cancer Center, il National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), il Gruss Lipper Biophotonics Center, l’Integrated Imaging Program for Cancer Research, una borsa di studio post-dottorato Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) e un premio per lo sviluppo della carriera METAvitor.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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