Sporing av spredning av tumorceller fra lungemetastaser ved hjelp av fotokonvertering
Summary
Vi presenterer en metode for å studere tumorcelleformidling fra lungemetastaser med kirurgisk protokoll for selektiv fotokonvertering av lungemetastaser, etterfulgt av identifisering av formidlede tumorceller i tertiære organer.
Abstract
Metastase – den systemiske spredningen av kreft – er den viktigste årsaken til kreftrelaterte dødsfall. Selv om metastase vanligvis betraktes som en ensrettet prosess hvor celler fra primærtumoren sprer seg og frømetastaser, kan tumorceller i eksisterende metastaser også spreseg og gi opphav til nye lesjoner på tertiære steder i en prosess kjent som “metastase-fra-metastaser” eller “metastase-til-metastasesåing.” Metastase-til-metastasesåing kan øke metastatisk belastning og redusere pasientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse av prosessene bak dette fenomenet avgjørende for å raffinere behandlingsstrategier for pasienter med metastatisk kreft.
Lite er kjent om metastase-til-metastasesåing, delvis på grunn av logistiske og teknologiske begrensninger. Studier av metastase-til-metastasesåing er primært avhengige av sekvenseringsmetoder, noe som kanskje ikke er praktisk for forskere som studerer den nøyaktige timingen av metastase-til-metastase-såhendelser eller hva som fremmer eller forhindrer dem. Dette fremhever mangelen på metoder som letter studiet av metastase-til-metastasesåing. For å løse dette har vi utviklet – og beskriver her – en murine kirurgisk protokoll for selektiv fotokonvertering av lungemetastaser, som tillater spesifikk merking og skjebnesporing av tumorceller som sprer seg fra lungen til tertiære steder. Så vidt vi vet, er dette den eneste metoden for å studere tumorcelle redisseminering og metastase-til-metastase såing fra lungene som ikke krever genomisk analyse.
Introduction
Metastase er den viktigste årsaken til kreftrelaterte dødsfall1. Metastatisk kreft oppstår når celler fra primærtumoren sprer seg gjennom hele kroppen og sprer seg til klinisk påvisbare svulster i fjerne organer 2,3.
Selv om metastase vanligvis betraktes som en ensrettet prosess hvor tumorceller sprer seg fra primærtumoren og koloniserer fjerne organer4, tyder økende klinisk og eksperimentelt bevis på at en mer kompleks, flerveis prosess er på spill. Det er vist at sirkulerende tumorceller kan reseed primærtumoren (hvis den fortsatt er på plass)5,6,7,8,9, og tumorceller fra eksisterende metastatiske foci kan reise til tertiære steder og gi opphav til nye lesjoner 10,11,12,13. Faktisk tyder bevis fra nyere genomiske analyser på at noen metastaserende lesjoner ikke oppstår fra primærtumoren, men fra andre metastaser – et fenomen kjent som “metastase-fra-metastaser” eller “metastase-til-metastasesåing”14,15,16. Metastase-til-metastasesåing kan videreføre sykdomsprosessen selv etter fjerning av primærtumor, øke metastatisk belastning og redusere pasientens livskvalitet og overlevelse. Derfor er forståelse av prosessene bak metastase-til-metastasesåing avgjørende for å raffinere behandlingsstrategier for pasienter med metastatisk sykdom.
Til tross for de potensielt alvorlige kliniske implikasjonene, er lite kjent om metastase-til-metastasesåing, delvis på grunn av logistiske og teknologiske begrensninger. Studier på mennesker er begrenset av mangel på kliniske prøver. Klinisk reseksjon og biopsi av metastaserende lesjoner er uvanlig, som er biopsi av tilsynelatende friske organer, hvor enkelt spredte tumorceller kan lure. Dette betyr at menneskelige studier vanligvis bare er mulig ved bruk av obduksjonsprøver fra personer hvis primære svulster enten fortsatt er på plass eller tidligere ble resektert, men er fortsatt tilgjengelige for forskere. Når slike prøver foreligger, må avstamningsanalyser av kreftprogresjon utføres ved hjelp av sekvenseringsmetoder14. Bulksekvensering av matchede primærtumorer og metastaser har imidlertid ikke den sensitiviteten som trengs for omfattende avstamningssporing. For eksempel kan bulksekvensering av en lesjon avsløre en subklon som ikke kan oppdages i noen av dens matchede lesjoner. I dette tilfellet ville man ikke kunne bestemme opprinnelsen til denne subklonen. Det kan ha vært tilstede i primærtumor eller annen metastase med en frekvens under deteksjonsgrensen, eller det kan ha oppstått etter den første koloniseringen av den metastatiske lesjonen den ble funnet i. Enkeltcellesekvensering gir økt følsomhet, men de høye kostnadene begrenser storskala anvendelse av denne teknikken. Studienes retrospektive karakter gjør også at de gir begrenset innsikt i forbigående metastatiske hendelser og sykdomslandskapet på ulike tidspunkter.
I dyremodeller tillater nyere teknologiske fremskritt nå prospektiv fylogenetisk kartlegging med høy romlig og tidsmessig oppløsning 17,18,19,20. Disse teknikkene bruker CRISPR / Cas9-genomredigering for å konstruere celler med en utviklende strekkode – arvelige mutasjoner som akkumuleres over tid. Ved sekvensering kan avstamningen til hver celle spores basert på mutasjonsprofilen til strekkoden 17,18,19,20. Faktisk brukes slik teknologi allerede til å kartlegge metastase-til-metastasesåing. I et nylig papir viste Zhang et al. at bryst- og prostatakreftceller i benmetastaser redisseminerer fra beinet til frø sekundære metastaser i flere organer21.
Selv om disse nye metodene har stort potensial til å generere detaljerte, høyoppløselige fylogenetiske kart over kreftprogresjon, er de svært upraktiske for de som studerer den nøyaktige timingen av metastase-til-metastase-såhendelser og hva som fremmer eller forhindrer dem. Å fylle disse kunnskapshullene er avgjørende for å foredle vår forståelse og behandling av metastatisk kreft, men det er en merkbar mangel på teknologier for å lette slike studier. For å imøtekomme dette behovet har vi nylig utviklet – og presenterer her – en ny teknikk som gjør at vi spesifikt kan merke tumorceller via fotokonvertering på et metastatisk sted (lungen) og deretter reidentifisere dem i tertiære organer. Ved hjelp av denne teknikken viste vi nylig at brystkreftceller sprer seg fra lungemetastaser og frø tertiære organer13. Denne teknikken kan også brukes til å bestemme tidspunktet for redissemineringshendelser innenfor et smalt vindu og kvantifisere redisseminerte tumorceller, forenkle studiet av organotropisme av redisseminerte celler og hva som fremmer / forhindrer spredning.
Mens fotokonvertering og lokalt induserbare cre / lox-systemer som permanent erstatter ett fluorescerende protein med et annet, tidligere har blitt brukt til å markere og spore tumorceller 11,22,23, så vidt vi vet, har ingen tilnærming for spatiotemporal markering av tumorceller blitt optimalisert for å målrette lungen – et av de vanligste stedene for metastase blant menn og kvinner diagnostisert med noen av de 14 vanligste kreftene 24. Enhver kreftcelletype og hvilken som helst protokoll for generering av lungemetastaser kan brukes med vår prosedyre, noe som gjør den bredt nyttig for metastaseforskere. Alle kreftceller som brukes til å generere lungemetastaser, skal uttrykke et fotokonvertibelt eller fotobyttebart protein, og forskere kan velge hvilket protein som skal brukes basert på deres spesifikke behov og ressurser. I denne studien brukte vi 6DT1 brystkreftceller som stabilt uttrykte det fotokonvertible grønne til røde fluorescerende proteinet Dendra2 (6DT1-Dendra2-celler)25 merket til histonen H2B. Vi injiserte 5,0 × 104 6DT1-Dendra2 celler i den fjerde brystfettputen til kvinnelige Rag2-/- mus. Primære svulster var palpable mellom 12 og 16 dager etter injeksjon og ble ikke resektert i løpet av forsøket. Spontane lungemetastaser utviklet seg mellom 19 og 26 dager etter injeksjon av tumorceller. Fotokonverteringsoperasjoner ble utført mellom 26 og 29 dager etter tumorcelleinjeksjon. Mus ble ofret etter 72 timer etter operasjonen på grunn av lungemetastasebelastning.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi en kirurgisk protokoll for selektiv fotokonvertering av tumorceller i lungen. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å selektivt markere tumorceller i lungen og spore deres skjebne ved å reidentifisere dem gjennom hele kroppen på et senere tidspunkt, noe som letter studiet av metastase fra lungemetastaser. Ved hjelp av denne protokollen var det mulig å visualisere fotokonverterte celler i hjernen, leveren og ikke-fotokonvertert høyre lunge hos mus som hadde gjennomgått operasjo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Wade Koba for hans hjelp med mikrocomputertomografi (S10RR029545), Vera DesMarais og Hillary Guzik fra Analytical Imaging Facility for opplæring og hjelp med mikroskopi, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, et Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z), og en METAvivor Career Development Award.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K. Clinical landscape of cancer metastases. Cancer Medicine. 7 (11), 5534-5542 (2018).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -. L., Zhang, Y., Cao, K. -. X., Wang, X. -. M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -. W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
