Rastreando a Disseminação de Células Tumorais a partir de Metástases Pulmonares Usando Fotoconversão
Summary
Apresentamos um método para estudo da redisseminação de células tumorais a partir de metástases pulmonares envolvendo um protocolo cirúrgico para fotoconversão seletiva de metástases pulmonares, seguido da identificação de células tumorais redisseminadas em órgãos terciários.
Abstract
A metástase – a disseminação sistêmica do câncer – é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Embora a metástase seja comumente pensada como um processo unidirecional em que as células do tumor primário se disseminam e semeiam metástases, as células tumorais em metástases existentes também podem se redisseminare dar origem a novas lesões em sítios terciários, em um processo conhecido como “metástase de metástases” ou “semeadura de metástase para metástase”. A semeadura de metástases para metástases pode aumentar a carga metastática e diminuir a qualidade de vida e a sobrevida do paciente. Portanto, compreender os processos por trás desse fenômeno é crucial para refinar as estratégias de tratamento de pacientes com câncer metastático.
Pouco se sabe sobre a semeadura de metástases para metástases, devido, em parte, a limitações logísticas e tecnológicas. Os estudos sobre a semeadura de metástases para metástases dependem principalmente de métodos de sequenciamento, o que pode não ser prático para os pesquisadores que estudam o momento exato dos eventos de semeadura de metástase para metástase ou o que os promove ou impede. Isso evidencia a falta de metodologias que facilitem o estudo da semeadura de metástases para metástases. Para resolver isso, desenvolvemos – e descrevemos aqui – um protocolo cirúrgico murino para a fotoconversão seletiva de metástases pulmonares, permitindo marcação específica e rastreamento do destino de células tumorais que se redisseminam do pulmão para sítios terciários. Até onde sabemos, este é o único método para estudar a redisseminação de células tumorais e a semeadura de metástases para metástases a partir dos pulmões que não requer análise genômica.
Introduction
Metástases são a principal causa de mortes relacionadas ao câncer1. O câncer metastático surge quando células do tumor primário se disseminam por todo o corpo e proliferam em tumores clinicamente detectáveis em órgãos distantes 2,3.
Embora a metástase seja comumente considerada como um processo unidirecional em que as células tumorais se disseminam a partir do tumor primário e colonizam órgãosdistantes4, evidências clínicas e experimentais crescentes sugerem que um processo multidirecional mais complexo está em jogo. Tem sido demonstrado que células tumorais circulantes podem resemear o tumor primário (se ainda existentes)5,6,7,8,9, e células tumorais de focos metastáticos existentes podem viajar para sítios terciários e dar origem a novas lesões10,11,12,13 . De fato, evidências de análises genômicas recentes sugerem que algumas lesões metastáticas não surgem do tumor primário, mas de outras metástases, fenômeno conhecido como “semeadura de metástases de metástases” ou “semeadura de metástase para metástase”14,15,16. A disseminação de metástases para metástases pode perpetuar o processo da doença mesmo após a remoção do tumor primário, aumentando a carga metastática e diminuindo a qualidade de vida e a sobrevida dos pacientes. Portanto, compreender os processos por trás da semeadura de metástase para metástase é crucial para refinar as estratégias de tratamento para pacientes com doença metastática.
Apesar das implicações clínicas potencialmente graves, pouco se sabe sobre a semeadura de metástases para metástases, devido, em parte, a limitações logísticas e tecnológicas. Os estudos em humanos são limitados pela escassez de amostras clínicas. A ressecção clínica e a biópsia de lesões metastáticas são incomuns, assim como a biópsia de órgãos aparentemente saudáveis, onde células tumorais disseminadas únicas podem se esconder. Isso significa que os estudos em humanos normalmente só são possíveis usando amostras de autópsia de indivíduos cujos tumores primários ainda estão em vigor ou foram ressecados anteriormente, mas ainda estão disponíveis para os pesquisadores. Quando essas amostras estão disponíveis, análises de linhagens da progressão do câncer devem ser realizadas por métodos desequenciamento14. No entanto, o sequenciamento em massa de tumores primários e metástases compatíveis não tem a sensibilidade necessária para o rastreamento abrangente da linhagem. Por exemplo, o sequenciamento em massa de uma lesão pode revelar um subclone que é indetectável em qualquer uma de suas lesões pareadas. Nesse caso, não seria possível determinar a origem desse subclone. Pode estar presente no tumor primário ou em outra metástase com frequência abaixo do limite de detecção, ou pode ter surgido após a colonização inicial da lesão metastática em que foi encontrado. O sequenciamento unicelular proporciona maior sensibilidade, mas seu alto custo limita a aplicação em larga escala dessa técnica. A natureza retrospectiva desses estudos também significa que eles fornecem informações limitadas sobre eventos metastáticos transitórios e o cenário da doença em diferentes pontos de tempo.
Em modelos animais, avanços tecnológicos recentes permitem o mapeamento filogenético prospectivo com alta resolução espacial e temporal 17,18,19,20. Essas técnicas utilizam a edição do genoma CRISPR/Cas9 para projetar células com um código de barras em evolução – mutações hereditárias que se acumulam ao longo do tempo. Após o sequenciamento, a linhagem de cada célula pode ser traçada com base no perfil mutacional de seu código de barras 17,18,19,20. De fato, essa tecnologia já está sendo usada para mapear a semeadura de metástase para metástase. Em trabalho recente, Zhang e col. demonstraram que células de câncer de mama e próstata em metástases ósseas se redisseminam do osso para semear metástases secundárias em múltiplosórgãos21.
Embora esses novos métodos tenham grande potencial para gerar mapas filogenéticos detalhados e de alta resolução da progressão do câncer, eles são altamente impraticáveis para aqueles que estudam o momento exato dos eventos de semeadura de metástase para metástase e o que os promove ou impede. Preencher essas lacunas de conhecimento é crucial para refinar nossa compreensão e tratamento do câncer metastático, mas há uma notável falta de tecnologias para facilitar tais estudos. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos recentemente – e apresentamos aqui – uma nova técnica que nos permite marcar especificamente células tumorais via fotoconversão em um sítio metastático (o pulmão) e, posteriormente, reidentificá-las em órgãos terciários. Recentemente, com essa técnica, demonstramos que células de câncer de mama se redisseminam a partir de metástases pulmonares e de órgãos terciários desementes13. Esta técnica também pode ser utilizada para determinar o momento dos eventos de redisseminação dentro de uma janela estreita e quantificar as células tumorais redisseminadas, facilitando o estudo do organotropismo das células redisseminadas e o que promove/impede a redisseminação.
Embora a fotoconversão e os sistemas cre/lox localmente induzíveis que substituem permanentemente uma proteína fluorescente por outra tenham sido usados anteriormente para marcar e rastrear células tumorais11,22,23, até onde sabemos, nenhuma abordagem para marcação espaço-temporal de células tumorais foi otimizada para atingir o pulmão – um dos sítios mais comuns de metástase entre homens e mulheres diagnosticados com qualquer um dos 14 cânceres mais comuns24. Qualquer tipo de célula cancerosa e qualquer protocolo para geração de metástases pulmonares podem ser usados com nosso procedimento, tornando-o amplamente útil para pesquisadores de metástases. Todas as células cancerosas usadas para gerar metástases pulmonares devem expressar uma proteína fotoconversível ou fotocomutável, e os pesquisadores podem escolher qual proteína usar com base em suas necessidades e recursos específicos. Neste estudo, usamos 6DT1 células de câncer de mama que expressaram de forma estável a proteína fluorescente fotoconversível verde-vermelho Dendra2 (células 6DT1-Dendra2)25 marcadas com a histona H2B. Foram injetadas 5,0 × 104 células 6DT1-Dendra2 no quarto coxim gorduroso mamário de fêmeas de camundongos Rag2-/-. Os tumores primários foram palpáveis entre 12 e 16 dias após a injeção e não foram ressecados durante todo o experimento. Metástases pulmonares espontâneas se desenvolveram entre 19 e 26 dias após a injeção de células tumorais. As cirurgias de fotoconversão foram realizadas entre 26 e 29 dias após a injeção das células tumorais. Os camundongos foram sacrificados 72 h após a cirurgia devido à carga de metástases pulmonares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, descrevemos um protocolo cirúrgico para a fotoconversão seletiva de células tumorais no pulmão. Essa técnica permite que os pesquisadores marquem seletivamente as células tumorais no pulmão e rastreiem seu destino, reidentificando-as em todo o corpo em um momento posterior, facilitando o estudo de metástases de metástases pulmonares. Com esse protocolo, foi possível visualizar células fotoconvertidas no cérebro, fígado e pulmão direito não fotoconvertido de camundongos submetidos à cirurgi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Wade Koba por sua assistência com microtomografia computadorizada (S10RR029545), Vera DesMarais e Hillary Guzik do Analytical Imaging Facility por seu treinamento e assistência com microscopia, ao Einstein Montefiore Cancer Center, ao National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), ao Gruss Lipper Biophotonics Center, ao Integrated Imaging Program for Cancer Research, uma bolsa de pós-doutorado Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) e um Prêmio METAvivor de Desenvolvimento de Carreira.
Materials
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72" BLACK/ZIP CORD | Mouser | 172-7426-E | |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs – single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA – Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
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