Hittil er protokoller for samtidig isolering av alle de viktigste celletypene i sentralnervesystemet fra samme mus et udekket behov. Protokollen viser en prosedyre som kan brukes i naive og eksperimentelle autoimmune encefalomyelittmus for å undersøke komplekse cellulære nettverk under nevroinflammasjon og samtidig redusere de nødvendige musetallene.
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er den vanligste murinmodellen for multippel sklerose (MS) og brukes ofte til å ytterligere belyse den fortsatt ukjente etiologien til MS for å utvikle nye behandlingsstrategier. Myelinoligodendrocyttglykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55) EAE-modellen gjengir et selvbegrensende monofasisk sykdomsforløp med stigende lammelse innen 10 dager etter immunisering. Musene undersøkes daglig ved hjelp av et klinisk skåringssystem. MS drives av ulike patomekanismer med et spesifikt temporalt mønster, og undersøkelsen av rollen til celletyper bosatt i sentralnervesystemet (CNS) under sykdomsprogresjon er derfor av stor interesse. Den unike egenskapen til denne protokollen er samtidig isolering av alle viktigste CNS-residente celletyper (mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og nevroner) som gjelder hos voksne EAE og friske mus. Dissosiasjonen av hjernen og ryggmargen fra voksne mus etterfølges av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) for å isolere mikroglia, oligodendrocytter, astrocytter og nevroner. Flowcytometri ble brukt til å utføre kvalitetsanalyser av de rensede encellede suspensjonene som bekreftet levedyktighet etter celleisolering og indikerte renheten til hver celletype på ca. 90 %. Avslutningsvis tilbyr denne protokollen en presis og omfattende måte å analysere komplekse cellulære nettverk i sunne og EAE-mus. Videre kan antallet nødvendige mus reduseres betydelig ettersom alle fire celletyper er isolert fra de samme musene.
Multippel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) preget av demyelinisering, aksonal skade, gliose og nevrodegenerasjon. Til tross for mange forskningstilnærminger på dette feltet, er patofysiologien til MS fortsatt ikke fullt ut forstått 1,2,3,4. Den vanligste dyremodellen for å undersøke MS er myelinoligodendrocytt glykoproteinpeptid 35-55 (MOG35-55)-indusert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) som deler mange av sine kliniske og patofysiologiske egenskaper 5,6,7,8,9 . Den er basert på immunsystemets respons mot CNS-spesifikke antigener som fører til betennelse, demyelinisering og nevroaksonal degenerasjon. Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en egnet modell for undersøkelse av nevroinflammatoriske veier og signalkaskader funnet ved MS.
Nåværende behandlingsalternativer for MS er bare delvis effektive og fokuserer primært på den første inflammatoriske fasen av sykdommen. Imidlertid synes den neurodegenerative komponenten av MS å være den største utfordringen for langsiktige terapeutiske tilnærminger. Derfor er reproduserbare og presise celleisolasjonsprotokoller nødvendig for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer i autoimmune sykdommer på en omfattende måte. Selv om noen protokoller for isolering av en enkelt celletype eksisterer 10,11,12,13,14,15, er det et udekket behov for samtidig isolering av flere CNS-residente cellepopulasjoner samtidig. Tidligere protokoller for isolering av CNS-residente celler mangler å bevare cellulær funksjonalitet og renhet, noe som resulterer i samdyrking med naboceller 16,17,18 eller uegnethet for komplekse analyser av intracellulære nettverk ex vivo 19,20,21,22.
Målet med denne protokollen var å etablere en reproduserbar og omfattende metode for samtidig isolering av rene levedyktige enkeltcellesuspensjoner av alle de viktigste CNS-residente celletypene som er anvendelige hos voksne friske og EAE-mus. De ulike celletypene ble isolert ved hjelp av magnetisk aktivert cellesortering (MACS)23. Celleseparasjonen kan oppnås enten ved positivt utvalg, dvs. magnetisk merking av celletypespesifikke overflatemarkører, eller ved negativ seleksjon via biotinylering og uttømming av alle uønskede celler. Flowcytometri ble anvendt for å sikre en renhet på over 90 % og en levedyktighet på minst 80 % av de isolerte encellede suspensjonene.
Avslutningsvis var hovedmålet å etablere en protokoll for samtidig isolering av alle hoved CNS-residente celletyper som et allsidig verktøy for undersøkelse av nevroinflammatoriske veier som tilbyr en omfattende og presis analyse av komplekse cellulære nettverk og biokjemiske signalkaskader hos friske og EAE-mus.
Så langt har metoder for å kartlegge CNS-residente celler ex vivo ved å kombinere massespektrometri og RNA-sekvensering gitt en svært presis cellulær profilering innen helse og sykdom, men krever ambisiøs teknisk kunnskap og kompetanse på dette feltet50,51. Videre tillater de ikke funksjonelle analyser og er svært dyre. Dessuten gir mikrofluidiske hjerne-på-brikke-systemer en rask og rimelig screening for sykdomsmekanismer og testing av nye terapeutiske tilnærminger med begrensning av cellevekst og migrasjon 52,53,54,55. CNS-organoider kan også i fremtiden representere et tilsvarende alternativ for undersøkelse av cellulær modellering, intercellulære forbindelser og interaksjoner under sykdomsforløp 56,57,58,59. Imidlertid er fluorescens- og magnetisk aktivert cellesortering for tiden de mest effektive metodene for å generere rene og levedyktige enkeltcellesuspensjoner ex vivo 35,60,61. Selv om andre etablerte produksjonsprotokoller for isolering av CNS-residente celletyper er like med hensyn til de enkelte trinnene i den magnetiske isolasjonen og den tidligere celledissosiasjonen, er de ment å utføres for hver celletype separat. Derimot integrerer den nåværende protokollen forskjellige isolasjonsmetoder for hver CNS-residente celletype i en logisk kontekst, slik at de kan utføres samtidig samtidig og fra en enkelt CNS-cellesuspensjon (tabell 1, tabell 2). Dermed muliggjør det multi-omics-analyser fra en enkelt CNS-cellesuspensjon og til slutt utforskning av komplekse nevrale nettverk. Selv om det ikke er et must å samle flere vev fra flere dyr for å utføre denne protokollen, sikrer denne sammenslåingen et tilstrekkelig antall isolerte celler for videre nedstrømsanalyse. Bruken av forskjellige mus for isolering av enkeltcelletyper vil utelukke muligheten for å analysere potensielle cellulære interaksjoner. Dessuten sparer kombinasjonen av individuelle isolasjonsmetoder for de forskjellige CNS-celletypene, som alle følger en tidligere CNS-dissosiasjon, materialkostnader ved å bruke en dissosiert CNS-cellesuspensjon for alle følgende magnetiske isolasjonstrinn. I tillegg minimeres en potensiell teknisk skjevhet forårsaket av bruk av forskjellige mus.
En begrensning av protokollen kan være den nesten eksklusive bruken av kvinnelige C57BL/6J-mus. EAE-immuniseringsprotokollen er designet og etablert for kvinnelige mus, så denne celleisolasjonsprotokollen ble også implementert i kvinnelige C57BL/6J-mus. Likevel ble naive hannmus også brukt under utviklingen av denne protokollen, uten å gjenkjenne noen effekt på det resulterende celleantallet eller renhetene. En annen begrensning påvirker magnetcelleisoleringen av nevroner, da det ikke eksisterer noen spesifikke mikroperler for isolering av nevroner når det gjelder et positivt utvalg. Man antok at en ren encellesuspensjon kunne oppnås via biotinmerking og deplesjon av alle ikke-nevronale celler (tab 2). Denne antagelsen ble bekreftet ved bruk av NeuN som en spesifikk nukleær markør for nevroner, integrert i det nevnte renhetspanelet for flowcytometri. En annen begrensning gjelder isolering av mikroglia i EAE-mus. Her reduseres resulterende celleutbytter i forhold til de andre celletypene på grunn av det ekstra sorteringstrinnet etter MACS-protokollen. Videre kan man argumentere for at sortering øker den mekaniske belastningen av mikroglia sammenlignet med de andre cellepopulasjonene. Individuelle sorteringsstrategier kan føre til forskjellige mengder celleutbytter. Hvis det isolerte celletallet er mindre enn forventet eller ønsket, anbefales det å justere gatingoppsettet og/eller forbedre diskrimineringen av levende/døde.
Et kritisk trinn i protokollen representerer fjerning av rusk. Gradienten må legges veldig sakte og forsiktig for å skape de tre ønskede separate fasene (figur 2A). Bare hvis myelin- og andre rester av rusk i de to øverste fasene fjernes helt (figur 2E), kan rene encellede suspensjoner genereres, og ytterligere forurensning kan reduseres. Hvis de resulterende cellesuspensjonene mangler renhet, er dette sannsynligvis den delen av protokollen som bør forbedres først ved siden av forsikringen om riktig bruk av alle mikroperler.
Å motta høye nivåer i renhet og levedyktighet kan være utfordrende i denne typen eksperiment. Noen anbefalinger for feilsøking er:
-Arbeid under sterile forhold er obligatorisk for å forhindre kontaminering av de forskjellige mikrokulene og muliggjøre gjentatt bruk, spesielt for senere dyrking.
-Merking av hver tube for å forhindre blandinger er sterkt anbefalt.
-Unngå bruk av ukjølte reagenser/buffere. Oppbevar alle cellesuspensjoner på is under hele forsøket for å sikre høy levedyktighet.
-Hold tiden mellom de ulike arbeidstrinnene så kort som mulig. Det er ingen spesifikk del i protokollen der det anbefales å sette eksperimentet på pause.
-Det er svært relevant å følge de angitte inkubasjonsperiodene.
Avslutningsvis gir denne nåværende protokollen for samtidig isolering av alle hoved CNS-residente celletyper fra en CNS-replikat muligheten til å analysere komplekse nevrale nettverk og nevroinflammatoriske veier ex vivo fra en CNS-cellesuspensjon. Dermed kan CNS-residente celler undersøkes under ulike stadier av sykdomsforløp, for eksempel under nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon og/eller remisjon i EAE. Videre kan celle-celle-interaksjoner og biokjemiske veier studeres på individnivå, og variasjon innen eksperimentelle grupper kan reduseres. Det er også mulighet for å dyrke fraksjoner av de isolerte CNS-cellene i monokulturer for videre funksjonelle analyser og validering. Alt i ett tilbyr denne protokollen betydelige fremskritt som potensielt påvirker prekliniske og kliniske forskningsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Figurene er laget med Adobe Illustrator (versjon 2023) og Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonia Henes ble støttet av Jürgen Manchot Stiftung.
70 μm cell strainers | Corning, MA, USA | 352350 | CNS tissue dissociation |
ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-116-244 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-107-677 | Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 °C; store the remaining kit at 4 °C |
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-097-678 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend, London, UK | 101301 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-094-543 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
AstroMACS Separation buffer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-221 | MACS of astrocytes, store at 4 °C |
Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-113-853 | Flow cytometry, store at 4 °C |
BRAND Neubauer counting chamber | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10195580 | Cell counting |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11) | BioLegend, London, UK | 103137 | Flow cytometry, store at 4 °C |
CD11b MicroBeads, human, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-049-601 | MACS of microglia, store at 4 °C |
DNAse I, recombinant, Rnase-free | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 4716728001 | Flow cytometry, store at -20° C |
D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14287080 | Buffer, store at 4 °C |
D-PBS, without calcium, without magnesium | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 14190250 | Buffer, store at 4 °C |
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 65-0865-14 | Flow cytometry, store at 4 °C |
eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 00-5523-00 | Flow cytometry, store at 4°C |
Falcon (15 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 11507411 | Cell tube |
Falcon (50 mL) | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10788561 | Cell tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 08-771-23 | Flow cytometry |
FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-092-575 | MACS of oligodendrocytes, store at 4 °C |
Female C57BL/6J mice | Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany | Active EAE induction | |
Fetal calf serum (FCS) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | F2442-50ML | Flow cytometry, store at -5 to -20 °C |
FITC Rat Anti-CD 11b (clone M1/70) | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 553310 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Freund’s Complete adjuvant | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | AR001 | Active EAE induction, store at 4 °C |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-093-237 | CNS tissue dissociation |
GentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-096-427 | CNS tissue dissociation |
Graphpad Prism 8.4.3 | Graphpad by Dotmatics | Graphical Analysis | |
Isoflurane | AbbVie, North Chicago, IL, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Kaluza Analysis Software V2.1.1 | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Flow cytometry analysis | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-401 | MACS |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-091-376 | PB-buffer |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-042-303 | MACS |
MOG35–55 peptide | Charité, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egrève, France) | Active EAE induction, store at -20 °C | |
Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra | Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA | Active EAE induction, store at 4 °C | |
Neuron Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-115-390 | MACS of neurons, store at 4 °C |
O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-119-897 | Flow cytometry, store at 4 °C |
Pertussis toxin in glycerol | Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA | BT-0105 | Active EAE induction; store at -20 °C |
pluriStrainer Mini 100 μm | pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany | 43-10100-40 | Flow cytometry |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany | 130-090-976 | MACS |
Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763) | Abcam, Cambridge, UK | EPR12763 | Flow cytometry, store at -20 °C |
Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm | Ted Pella, Redding, CA, USA | 15067 | CNS tissue dissection |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15250061 | Cell counting |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 15575020 | Flow cytometry, store at room temperature |