Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) fungerer som en dyremodel af multipel sklerose. Denne artikel beskriver en tilgang til scoring af rygmarvsbetændelse, demyelinering og aksonal skade i EAE. Derudover præsenteres en metode til kvantificering af opløselige neurofilamentlysniveauer i museserumet, hvilket letter vurderingen af aksonal skade hos levende mus.
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er en almindelig immunbaseret model af multipel sklerose (MS). Denne sygdom kan induceres hos gnavere ved aktiv immunisering med proteinkomponenter i myelinskeden og Complete Freunds adjuvans (CFA) eller ved overførsel af myelinspecifikke T-effektorceller fra gnavere primet med myelinprotein / CFA til naive gnavere. Sværhedsgraden af EAE scores typisk på en 5-punkts klinisk skala, der måler graden af stigende lammelse, men denne skala er ikke optimal til vurdering af omfanget af genopretning fra EAE. For eksempel forbliver kliniske scorer høje i nogle EAE-modeller (f.eks. Myelin oligodendrocytglycoprotein [MOG] peptidinduceret model af EAE) på trods af opløsningen af inflammation. Det er således vigtigt at supplere klinisk scoring med histologisk scoring af EAE, som også giver et middel til at studere de underliggende mekanismer for cellulær skade i centralnervesystemet (CNS).
Her præsenteres en simpel protokol til at forberede og plette rygmarvs- og hjernesektioner fra mus og til at score betændelse, demyelinering og aksonal skade i rygmarven. Metoden til scoring af leukocytinfiltration i rygmarven kan også anvendes til at score hjernebetændelse i EAE. Der beskrives også en protokol til måling af opløseligt neurofilamentlys (sNF-L) i serum hos mus ved hjælp af et SIMOA-assay (Small Molecule Assay), som giver feedback om omfanget af den samlede CNS-skade hos levende mus.
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) er den mest almindelige murinmodel for den humane demyeliniserende sygdom, multipel sklerose (MS)1. Klassisk MS-inflammatorisk patologi, herunder infiltration af IFN-γ (gamma) og IL-17-producerende T-hjælperceller2, infiltration af inflammatoriske monocytter3, dannelsen af perivaskulære og submeningeal inflammatoriske demyeliniserende læsioner4 og forekomsten af axonskade4 i centralnervesystemet (CNS), observeres også i EAE 5,6,7,8,9. Ligheden i immunmekanismer mellem EAE og MS har gjort EAE til en passende præklinisk model til test af effektiviteten og virkningsmekanismerne for en række godkendte immunbaserede terapier til MS, herunder natalizumab, fingolimod, dimethylfumarat og glatirameracetat (gennemgået i 1,5). Visse EAE-regimer modellerer andre aspekter af progressiv MS-patologi ud over aksonal skade, herunder udvikling af submeningeal inflammation i hjernen, kronisk demyelinisering, rygmarvsatrofi, synaps og neurontab 6,10,11,12. Således har EAE nytte til screening af effekten af neurobeskyttende terapier for MS.
EAE induceres hos gnavere på en række måder. Aktiv immunisering er den mest almindelige induktionsmetode og involverer immunisering af gnavere med myelinantigener (enten hele proteiner eller peptider) emulgeret i CFA suppleret med varmedræbt Mycobacterium tuberculosis13. Afhængigt af musens stamme administreres kighostetoksin (PTX) også på dag 0 og dag 2 af immunisering for at øge penetransen af sygdom13. EAE kan også induceres ved adoptivt at overføre myelinspecifikke T-celler opnået fra myelin/CFA-primede mus til raske mus14 eller kan udvikle sig spontant hos mus, der overudtrykker T-cellereceptorer, der er specifikke for de vigtigste myelinantigener5.
EAE sygdom sværhedsgrad og progression er almindeligt scoret ved hjælp af en diskret 5-punkts klinisk skala: 1 – hale halthed, 2 – bagben eller fodsvaghed, 3 – fuldstændig lammelse i en eller begge bagben, 4 – forben svaghed, 5 – døende eller død13. Dette kliniske scoringssystem er sundt til at dokumentere progressionen af stigende lammelse, der opstår ved sygdomsdebut, men er mindre følsomt til at fange omfanget af genopretning fra CNS-inflammatoriske angreb. For eksempel tildeles både mus, der ambulerer med vanskeligheder, og mus, der let ambulerer, men udviser fodgribende svaghed, en score på 2 på EAE-skalaen. Scores kan forblive høje i den post-akutte fase af EAE på grund af tilstedeværelsen af permanent axonskade eller tab, selv på trods af opløsningen af det inflammatoriske respons9. Der har været en række forsøg på at udvikle mere raffinerede scoringssystemer, adfærdstest, målinger af bagben og grebstyrke og infrarøde overvågningssystemer for bedre at fange forskelle i kliniske underskud i EAE 9,16,17,18; Disse mere indviklede scoringsforanstaltninger skelner imidlertid ikke bidraget fra inflammation versus vævsskade til de underliggende neurologiske underskud. Således er guldstandardmetoden til at score sværhedsgraden af EAE at udføre både klinisk og histologisk scoring.
Her beskrives en protokol for, hvordan man dissekerer og indlejrer musens rygmarv og hjerneprøver i paraffin på en måde, der fanger den stokastiske proces med læsionsdannelse, der forekommer i EAE. Der præsenteres også en protokol for, hvordan man pletter sektioner med Luxol fast blue (LFB), oprindeligt oprettet af Kluver og Barrera19, som registrerer myelin i CNS. Sektioner er enten farvet med LFB alene (til demyeliniseringsanalyse) eller er modfarvet med hæmatoxylin og eosin (H & E) for at hjælpe med at visualisere og score inflammatoriske læsioner. Der leveres også protokoller til kvantificering af tilstedeværelsen af samlede leukocytter (CD45), tabet af myelin og antallet af skadede axoner (SMI-32) i rygmarven ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer, immunohistokemiske (IHC) teknikker og offentligt tilgængelig software. Protokollen, der bruges til at kvantificere leukocytter i rygmarven, kan også anvendes til at kvantificere leukocytter i hjernen.
Histologisk evaluering af aksonalt tab og skade i hjernen er forholdsvis vanskeligere end i rygmarven, da hjernens hvide stofkanaler ikke løber parallelt med hinanden. Måling af serum neurofilament lys (sNF-L) har vist sig at være en lovende biomarkør for neuronal skade i MS20,21. Nylige undersøgelser har udvidet denne teknologi til EAE 22,23,24. Her præsenteres en metode til måling af serum neurofilament lys (sNF-L) i levende mus ved hjælp af et Small Molecule Assay (SIMOA) assay. Denne metode kræver kun en lille mængde serum og kan udføres i levende mus på bare en halv dag, hvilket giver hurtig feedback om, hvordan en testet terapi påvirker den samlede CNS-skade. Alle de metoder, der er beskrevet her, kan anvendes på mus af ethvert køn eller stamme.
Histologisk farvning af rygmarven er et vigtigt redskab til vurdering af sværhedsgraden af sygdommen i EAE, især i tilfælde, hvor der er forskelle mellem behandlingsgrupper i omfanget af sygdomsgenopretning i den postakutte fase af sygdommen. Farvning til immuncelleinfiltration (CD45), myelin (LFB) og aksonal skade (SMI-32) hjælper med at karakterisere den underliggende årsag til de ændrede kliniske score hos mus. Den histologiske farvningsprotokol, der er beskrevet her, giver et perspektiv på inflammation såvel som omfanget af myelin og aksonal skade. Desuden validerer de viste resultater sNF-L-måling som en metode til at vurdere omfanget af den samlede neuronale skade i EAE.
De kritiske parametre for denne analyse er at sikre, at forskerne er blinde for sektionernes identitet, og at der er ækvivalent prøveudtagning på hvert niveau af rygmarven på tværs af de forskellige mus. Dette skyldes, at sværhedsgraden af betændelse kan være større ved lavere niveauer af ledningen. En anden kritisk parameter er størrelsen af de eksperimentelle grupper. Rygmarv og hjerner høstes typisk fra 6-8 mus pr. gruppe ved endepunktet for at se signifikante forskelle mellem grupper med behandlinger eller genotyper med beskedne effektstørrelser. Det er også vigtigt at sikre, at udvalgte mus, når gennemsnittet er gennemsnitligt, har repræsentative gennemsnitlige scorer for hele gruppen. Med hensyn til fejlfinding er et almindeligt problem, som dem, der er uerfarne med protokollen, støder på, at rygmarven er fastgjort i utilstrækkelig tid, og den ekstruderes ikke let fra rygsøjlen. Hvis dette er tilfældet, kan rygmarven manuelt dissekeres fra søjlen ved at klippe langs de spinøse processer ved hjælp af fin saks og åbne søjlen for at afsløre rygmarven. Alternativt kan væv fastgøres i et par ekstra dage uden at forstyrre succesen med antistoffarvning. De antistofkloner, der er beskrevet her, virker i væv fikseret op til 2 uger i formalin.
Indlejring af rygmarvsstykkerne kræver dygtighed og øvelse. Det anbefales, at øjenloupes bæres, og at en lampe rettes over indlejringsstationen for bedre at visualisere, om sektionerne falder i tværsnit eller i længdesnit. At holde længden af rygmarvsstykkerne på mindre end 2 mm under brutto hjælper dem med at falde i tværsnit. Et andet almindeligt problem, der opstår for mindre erfarne brugere, er, at LFB fordamper under inkubationen natten over, hvilket efterlader halvdelen af diaset farvet og halvt ufarvet. For at undgå fordampning skal glasfarvningsskålen forsegles med termoplastisk film og derefter plastfolie. Hvis der sker fordampning, og sektionerne er ujævnt farvede, anbefales det at fjerne diasene helt med lithiumcarbonat og plette dem igen i LFB natten over. Et andet almindeligt problem er, at brugerne ikke helt de-blå den grå substans efter LFB. Det er afgørende at undersøge de enkelte sektioner under mikroskopet for at sikre, at der er opnået en tilstrækkelig mængde de-bluing, før man fortsætter med andre trin i protokollen. Selvom CD45- og SMI-32 IHC-pletterne fungerer robust, er det stadig vigtigt at fejlfinde antistofkoncentrationer i foreløbige eksperimenter for hvert nyt antistofparti, der modtages. Dette kan gøres ved at teste en række koncentrationer af antistoffet på en positiv kontrolsektion (EAE rygmarv). Førstegangsfarvning bør også omfatte en negativ kontrol, der består af sekundært antistof alene uden tilsætning af primært antistof. Endelig er det afgørende i billedanalysen at tærskel individuelle billeder, da farvning kan være ujævn på tværs af dias eller sektioner.
Denne protokol bruger frit tilgængelig software. Hvis man ikke har adgang til en processor, en embedder eller mikrotom, kan disse trin hentes til en hospitalsbaseret patologikerne, der tilbyder disse tjenester. Hvis man ikke har adgang til en diasscanner, kan man også bruge et lysmikroskop, der er udstyret med et videokamera til at gemme TIFF-billeder af rygmarven eller hjerneområderne. For en mikroskopbaseret arbejdsgang skal du optage LFB- eller LFB/H&E-sektioner ved lav effekt (40x forstørrelse) og for CD45- og SMI-32-farvning skal du afbilde mindst fire vinduer, der er centreret i rygmarvens ventrale, dorsale og laterale dele (200x forstørrelse for CD45 og 400x forstørrelse for SMI-32). Billedanalyse kan udføres på disse billeder for at kvantificere farvning på en lignende måde som beskrevet.
Beslutningen om, hvilken histologisk tilgang der skal tages for at score EAE, afhænger af, hvor meget de kliniske score varierer mellem grupperne. For eksempel, hvis der er drastiske forskelle i EAE klinisk score (en gruppe fik EAE og en gjorde ikke), vedrører dette normalt forskelle i perifer medieret inflammation. I dette tilfælde er scoring for tilstedeværelsen af demyeliniserende læsioner på LFB / H & E-farvede sektioner tilstrækkelig og vil afsløre forskelle mellem grupper. Hvis grupperne er mere ens i klinisk score ved debut, og der i stedet er forskelle i omfanget af klinisk bedring (f.eks. eksperiment i figur 5A), er det bedst at anvende den fulde histologiske arbejdsgang, der er skitseret her, herunder scoring af hjernebetændelse i hjernestammen og lillehjernen, for at skelne mellem, om forskellene i sygdomskronicitet vedrører forskelle i inflammation eller vævsskade. Hvis der findes forskelle i inflammation som vurderet ved CD45-tælling, kan der udføres yderligere IHC-undersøgelser for at plette for T-celler (anti-CD3), infiltrerende monocyt / makrofager (Mac3) og mikroglia (Iba-1 / TMEM119) (anbefalede antistofkloner er i supplerende tabel 3). Microglia-aktivering afspejles af en stigning i intensiteten af Iba-1-farvning på dobbeltmærket Iba-1 + TMEM-19+ mikroglia og en øget tilbagetrækning af mikrogliaprocesser, der kan vurderes ved Sholl-analyse på afsnit32. Desuden kan teknikker som flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekventering anvendes til at udføre en dybere karakterisering af frekvensen og fænotypen af immunpopulationer i hjernen og rygmarven.
Optællingen af SMI-32+ axoner er en følsom metode til påvisning af axonskade i EAE32,33 og i MS34. SMI-32, som detekterer den ikke-fosforylerede form af neurofilament tung eller medium akkumuleres i endepærer af transekterede neuroner. Et alternativ til at detektere skadede axoner er at plette med amyloidforløberprotein (APP), der kan akkumulere i axoner som følge af forstyrret axontransport33. Farvningsmønsteret for SMI-32 og APP, selvom begge afspejler axonskade, overlapper typisk ikke hinanden, hvilket indikerer, at de detekterer forskellige patologier33. Man kan også supplere histologiske målinger af axonskade ved at måle sNF-L, som er et hurtigt og følsomt mål for igangværende aksonal skade i både rygmarven og hjernen. Det giver den fordel, at det kan gøres på en halv dag i levende mus. En ulempe ved denne metode er, at sættene er dyre, og maskinen er højt specialiseret. Virksomheden, der sælger sNF-L-sættet, tilbyder et gebyr for service til dem, der ikke har adgang til en SIMOA-maskine. Et alternativ til vurdering af axonskade er at score for axontab ved enten at tælle axoner i toluidinblåfarvede sektioner af rygmarven12 eller tælle neurofilamentbundter detekteret af SMI-31 i områder af rygmarvens hvide substans32. Begge disse er mere besværlige tilgange end SMI-32 eller sNF-L-måling.
Hvis EAE kliniske score varierer mellem grupper, men scoring for inflammation, demyelinering og aksonal skade ikke afslører forskelle mellem grupper, kan det være nyttigt at plette for astrocytaktivering ved hjælp af GFAP (se supplerende tabel 3 for anbefalet antistofklon). Astrocytaktivering er forbundet med en stigning i GFAP-farvning, og dette har vist sig at korrelere med EAE-progression i nogle EAE-modeller, herunder kronisk EAE i DA-rotten35.
Afslutningsvis beskriver denne protokol metoder og giver en analysearbejdsgang til udførelse af histologisk scoring af EAE.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Raymond Sobel (Stanford University) for at vise os hans metode til at brutto og rette hjerne- og rygmarvssektioner. Vi takker Kyle Roberton og Milan Ganguly fra Toronto Center for Phenogenomics for at lære indlejringsmetoden og for at skære så mange af vores hjerne- og rygmarvssektioner. Vi takker Dr. Matthew Cussick og Dr. Robert Fujinami (University of Utah) for at dele deres protokoller for scoring af submeningeal og perivaskulær betændelse i rygmarven. Vi takker Shalina Ousman for at dele klonen af CD45-antistoffet. Vi takker Xiofang Lu for træning på vævsprocessoren og vævsindlejringsstationen og vedligeholdelse af dette udstyr på Keenan Research Center of Biomedical Research på St. Michael’s Hospital. Dette arbejde blev støttet af et biomedicinsk tilskud fra MS Canada (til SED). Carmen Ucciferri støttes af et studieophold fra Canadas regering. Nuria Alvarez-Sanchez støttes af et Keenan postdoktoralt stipendium.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |