Hier presenteren we een protocol om nociceptie te evalueren bij muizen die zijn geïnfecteerd met Trypanosoma evansi, met behulp van het elektronische von Frey-apparaat als hulpmiddel, waarbij mechanische drempels van de achterpoot en ingewanden worden gemeten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Electronic von Frey geassocieerd met de Mouse Grimace Scale om allodynie en pijn te beoordelen bij met Trypanosoma evansi geïnfecteerde muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De pathogenese van infectieziekten is nog steeds een complex vakgebied om te bestuderen. Het verloop van verschillende klinische symptomen, zoals allodynie en pijn, kan worden waargenomen bij huisdieren. De kennis van hun routes en de juiste behandeling vereisen echter gecontroleerde experimenten, waarvan vele met behulp van proefdieren. Het meten van veranderingen in mechanische drempels van de achterpoot en ingewanden is een nuttige techniek om veranderingen in pijnperceptie bij knaagdieren waar te nemen. De ontwenningsreactie kan eerst worden gemeten in baselinetests, wat zorgt voor een betere controle van experimentele groepen. Daaropvolgende tests kunnen worden uitgevoerd na het induceren van een infectie en het toevoegen van medicijnen aan het protocol. Het gebruik van een elektronisch von Frey-apparaat in combinatie met het gebruik van een gezichtsschaal om pijnachtige veranderingen waar te nemen, maakt een eenvoudige, nauwkeurige en consistente beoordeling mogelijk om allodynie en pijn bij muizen te evalueren. Experimenten met de huidige methodologie voor Trypanosoma evansi-infectie vormen dus een nuttige methode om allodynie en pijn bij in het laboratorium geïnfecteerde dieren te evalueren, die kan worden toegepast op de conventionele behandeling van veedieren.
Inleiding
Trypanosoma evansi is de etiologische verwekker van de ziekte die in Zuid-Amerika "surra" of "mal-das-cadeiras" wordt genoemd 1,2. Het treft vaak paardachtigen en runderen, maar ook wilde fauna, en wordt overgedragen door hematofaag vleermuizen, tabaniden en stomoxen vliegenbeten 1,3. Surra is een belangrijke ziekte bij huisdieren, die dodelijk kan zijn bij afwezigheid van de juiste behandeling, met niet-specifieke klinische symptomen zoals bloedarmoede, verlies van eetlust en gewicht, spierzwakte en abortus, die kunnen variëren afhankelijk van de gastheer en geografische regio 2,4,5,6.
De expressie van allodynie en pijn bij geïnfecteerde dieren tijdens het verloop van de ziekte is nog een nieuw onderwerp 2,7. De drang om de pathogenese achter deze symptomen te begrijpen, is een belangrijke stap om de momenteel gebruikte behandeling te verbeteren en te verfijnen door effectieve pijnstillers toe te voegen aan het klassieke trypanocidale protocol 5,6. In dit scenario is de mogelijkheid om de ziekte te repliceren met behulp van een muizenmodel een voordeel, aangezien muizen gemakkelijk in gecontroleerde omgevingen in het laboratorium kunnen worden gehouden en daarom resultaten kunnen opleveren die consistenter zijn dan veldexperimenten met vee.
Een mechanische drempel wordt gewoonlijk verkregen met behulp van een elektronisch von Frey (EvF) -apparaat voor de evaluatie van allodynie in een groot aantal experimenten 2,8,9. Dit apparaat wordt gebruikt om de gevoeligheid van het weefsel voor mechanische stimulatie te beoordelen: zodra het apparaat de poot van het dier raakt, wordt via een punt van 20-200 μL die aan het apparaat is bevestigd, de kracht geregistreerd waarmee het dier de poot terugtrekt.
Knaagdieren worden meestal gebruikt als standaarddieren in deze experimenten en de meeste resultaten worden geëxtrapoleerd naar andere soorten, aangezien de meeste onderzochte ziekten afkomstig zijn van andere soorten waarbij het moeilijk zou zijn om een gecontroleerd onderzoek uit te voeren. Bovendien zijn allodynie en pijn nauw met elkaar verbonden. Het gebruik van een specifieke gezichtsschaal om pijn bij geïnfecteerde muizen te evalueren, speelt een belangrijke rol als bevestigend adjuvans om de aanwezigheid van pijn tijdens het verloop van T. evansi-infectie te bevestigen 2,10.
In dit protocol demonstreren we een nieuw model om allodynie en pijn te evalueren bij muizen die experimenteel zijn geïnfecteerd met T. evansi, waarbij we een hoge correlatie tussen variabelen laten zien en daarmee een sterk model blijken te zijn. Bovendien is er een klein aantal onderzoekers nodig om de hele procedure uit te voeren, waardoor de kans op menselijk ingrijpen tijdens het experiment wordt verkleind. Het stelt de onderzoeker ook in staat om de doelziekte tijdens een acuut beloop te repliceren en verschillende behandelingsgeneesmiddelen toe te voegen aan het experimentele ontwerp, waardoor in korte tijd consistente resultaten worden verkregen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd met volwassen vrouwelijke Zwitserse muizen van 10 weken oud (35-55 g). De dieren werden gehuisvest in kooien van polysulfon (3-5 dieren per kooi) in een ruimte met gecontroleerde temperatuur (21 ± 1 °C), 12 uur licht/12 uur donkercyclus en standaard laboratoriumvoer en water ad libitum. In elke test werden tien dieren aan elke groep toegewezen om de consistente effecten van medicamenteuze behandelingen aan te tonen. Het experimentele ontwerp werd ingediend en goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Santa Catarina State University (CEUA) (protocolnummer: 6019201123). Alle dierproeven voldeden aan de ARRIVE-richtlijnen (Animal Research: Reporting of in vivo Experiments) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Bereiding en inoculatie van trypanosoma evansi
LET OP: Draag een wegwerplaboratoriumjas, handschoenen, masker en oogbescherming bij het hanteren van geïnfecteerde bloedmonsters, reagentia en andere chemische verbindingen.
- Schakel de waterbaduitrusting in en stel deze in op een constante temperatuur van 37 °C.
- Haal een microcentrifugebuisje met het geconserveerde bloedmonster uit de ultravriezer (-80 °C). Plaats het in het waterbad tot het bloed ontdooit.
OPMERKING: Hetzelfde isolaat moet worden gebruikt om alle muizen in elke groep van verschillende experimenten te infecteren om een gelijk aantal bloedpassages te behouden. - Gebruik fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,1 M) met 60% D-(+)-glucose (pH 7,4) om seriële verdunning (10:1 v v) uit te voeren totdat 1 ×10 4 trypanosomen per 0,1 ml zijn bereikt. Bepaal het aantal parasietcellen door handmatige celtelling met behulp van een Neubauer-kamer op een microscoop met een 100x objectieflens2.
- Inoculeer 0,1 ml van de verdunde bloedoplossing (geïnfecteerde groep), of hetzelfde volume in 0,9% zoutoplossing (controlegroep), intraperitoneaal, met behulp van een naald van 26 G 1/2" gekoppeld aan een insulinespuit.
2. Installatie en bediening van elektronische von Frey-apparaten
OPMERKING: Wees voorzichtig met de manier waarop de verkregen gegevens worden vastgelegd. Sommige EvF-apparatuur heeft specifieke programma's om de verkregen gegevens van het apparaat over te dragen naar andere elektronische apparaten, zoals computers, tablets of smartphones.
- Zet het EvF-apparaat aan. Zorg ervoor dat de apparatuur goed is opgeladen voordat u met het experiment begint, observeer het batterijniveau dat op het scherm van de apparatuur wordt weergegeven en laad deze indien nodig op.
- Verbind het EvF-apparaat via Wi-Fi met het gekozen elektronische apparaat om de verkregen gegevens over te dragen en op te slaan.
- Steek een polypropyleen punt van 10 μl in de kegel van het EvF-apparaat en stel de uitlezing in op nul (0.00 g) door op de knop met een pootsymbool te drukken.
- Merk op dat zodra het geëvalueerde weefsel is onderzocht; de maximaal uitgeoefende druk wordt weergegeven op het display van het EvF-apparaat. Breng het daarna over naar het gekozen elektronische apparaat door op de knop met een antennesymbool te drukken voor een veilige opname.
- Zet de uitlezing terug op nul en maak je klaar om een nieuwe meting uit te voeren door simpelweg nogmaals op de knop met het pootsymbool te drukken.
3. Algemene overwegingen voor de beoordeling van mechanische drempelwaarden
- Voer alle experimenten uit in een rustige kamer met een gecontroleerde temperatuur van 21 °C en een cyclus van 12 uur licht/12 uur donker, en zorg ervoor dat u de circadiane cyclus van de muis respecteert door alle evaluaties op hetzelfde tijdstip van de dag uit te voeren2.
- Laat dezelfde persoon zowel basislijn- als experimentele mechanische drempelbeoordelingen uitvoeren om vertekening te verminderen en de consistentie van de meting te waarborgen; Zorg ervoor dat de experimenten geblindeerd zijn.
- Plaats elke muis voorzichtig in een afzonderlijke kamer van polymethylmethacrylaat (PMMA) met een geperforeerde bovenkant op eenvloerstandaard van 5 mm² 2,8.
- Laat de muizen 30 minuten acclimatiseren in de PMMA-kamers voordat u zowel de basislijn als de experimentele mechanische drempels beoordeelt2.
- Plaats de gaasvloerstandaard op een comfortabele hoogte (op een stabiele ondergrond) zodat de dieren van alle kanten toegankelijk zijn. Zorg ervoor dat de buik en alle vier de poten van de muizen gemakkelijk toegankelijk zijn via de openingen in de gaasvloer.
- Bedek het stabiele oppervlak dat wordt gebruikt om de kamers toe te wijzen met absorberend materiaal om mictie en ontlasting te absorberen of op te vangen. Zorg ervoor dat de armen van de onderzoeker vrij kunnen bewegen onder de kamers tijdens het bedienen van het EvF-apparaat.
4. Baseline mechanische drempelbeoordeling en reactie van muizen op stimuli
- Voor buikmetingen verdeelt u de buik in drie virtuele delen (craniale, medium en caudale gebieden). Kies het craniale gebied (anatomisch met de lever) als het standaard doelweefsel voor viscerale allodynie mechanische drempelbeoordeling. Kies voor pootmetingen de rechter achterpoot voor standaardisatie.
- Doe 48 uur voor de infectie een nulmeting van elke muis. Om dit te doen, plaatst u de muizen in de bevattende kamers, bereidt u het EvF-apparaat voor en gebruikt u beide handen om de sonde langzaam op te tillen om het beoogde weefsel te stimuleren.
- Verhoog geleidelijk de druk op het weefsel totdat de muis nociceptief gedrag vertoont. Zoek voor de evaluatie van de rechterachterpoot naar het intrekken van de poten, het likken van de poten of het springen met vier poten 2,8,9. Zoek voor viscerale evaluatie naar een scherpe terugtrekking van de buik, onmiddellijk likken of krabben van de onderzochte plaats, of springen met vier poten 2,11.
- Sla de verkregen waarde op door de gegevens over te brengen naar het gekozen elektronische apparaat dat het specifieke EvF-programma bevat of door ze in een cijferlijst te schrijven. Zet het display terug op nul en herhaal het proces vier keer om vijf metingen te verkrijgen8.
OPMERKING: Beschouw slechts drie vergelijkbare metingen om de gemiddelde waarde2 te schatten - Meet de mechanische drempel van de muis die in de aangrenzende kamer aanwezig is totdat elke muis vijf keer wordt onderzocht en een gemiddelde waarde voor elk dier is verkregen.
- Herhaal de basismetingen 24 uur later en sluit muizen uit met gemiddelde waarden lager dan 3,00 g of met verschillen tussen basale metingen hoger dan 2,00 g 2,8.
OPMERKING: In elk experiment moet voor elke muis slechts één doelweefsel worden gekozen, zodat de dieren niet wennen aan het worden gesondeerd, aangezien het aantal evaluaties in korte tijd aanzienlijk hoger zou zijn.
5. Experimentele beoordeling van de mechanische drempel van de rechterachterpoot en viscerale allodynie
- Beoordeel de mechanische drempel van de rechterachterpoot of viscerale allodynie 1 uur na de infectie voor evaluatie op dag 0.
- Herhaal de procedure elke 24 uur gedurende 5 dagen na infectie.
OPMERKING: als er een behandeling moet worden toegediend, kies dan een geschikt tijdstip binnen het experimentele ontwerp. - Breng de muizen terug naar hun oorspronkelijke kooien om te voorkomen dat dieren met elkaar vechten, met toegang tot standaard laboratoriumvoer en water ad libitum nadat de metingen zijn voltooid.
- Voer een normaliteitstest uit om de normale verdeling van de gegevens te controleren en verdere passende statistische analyse van de verzamelde gegevens.
6. Beoordeling van de grimasschaal van muizen
- Zorg ervoor dat elke muis gemakkelijk te zien is in de insluitende kamer en onderzoek elke muis voorafgaand aan het experiment om er zeker van te zijn dat er geen laesies op de ledematen, buik of gezicht zijn en geen vachtveranderingen.
- Observeer het oogkas van de muis. Classificeer open ogen als een afwezigheid van pijn (score 0), terwijl een duidelijke pijn kan worden weergegeven wanneer de muis zijn ogen sluit (score 2).
- Observeer de neus van de muis. Classificeer een normale neus als de afwezigheid van pijn, terwijl de aanwezigheid van een uitstulping op de neusbrug duidelijke pijn vertegenwoordigt.
- Let op de wangen van de muis. Classificeer normale wangen als de afwezigheid van pijn, terwijl de aanwezigheid van een uitstulping op beide wangen duidelijke pijn vertegenwoordigt.
- Let op de positie van de oren van de muis. Classificeer ronde oren als de afwezigheid van pijn, terwijl oren die naar buiten of naar achteren draaien, weg van het gezicht, in een puntige vorm, duidelijke pijn vertegenwoordigen. De ruimte tussen de oren neemt toe met de pijnscore.
- Let op de snorharen van de muis. Classificeer snorharen met hun natuurlijke neerwaartse curve als de afwezigheid van pijn, terwijl snorharen die ofwel naar achteren tegen de wang worden getrokken of naar voren worden getrokken, duidelijke pijn vertegenwoordigen.
- Aangezien aangeboren gedrag, zoals zelfverzorging, de gezichtsuitdrukking kan verstoren, moet u dit niet als pijngerelateerd gedragbeschouwen. Wacht tot de muis dit gedrag heeft gestopt voordat u elke evaluatie van de actie-eenheid uitvoert.
- Voer een normaliteitstest uit om de normale verdeling van de gegevens te controleren en verdere passende statistische analyse van de verzamelde gegevens.
OPMERKING: Aan het einde van alle experimenten werden muizen op humane wijze geëuthanaseerd met ketamine (90 mg/kg) en xylazine (7,5 mg/kg), intraperitoneaal geïnjecteerd. Na het bereiken van een bevestigd diep anesthesieplan, werden ze onderworpen aan cervicale dislocatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Afname van de mechanische drempel als gevolg van T. evansi-infectie zoals geëvalueerd door elektronische von Frey-apparaten op zowel de rechterachterpoot als viscerale weefsels
Het experiment werd gedurende 5 dagen uitgevoerd, volgens eerdere gegevens met betrekking tot de beschikbare T. evansi-monster 2. Geïnfecteerde muizen begonnen op dag 3 na infectie een significant verschil te vertonen in mechanische drempel op de rechterachterpoot en bleven significant ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een cruciale stap in experimenten met geïnfecteerde dieren is de beheersing van parasitemieniveaus. Verschillende stammen van T. evansi kunnen zich bij muizen op uiteenlopende manieren gedragen, wat leidt van acute tot chronische infecties 2,4,5,6. Bovendien kunnen veranderingen in de infectiedosis de overlevingstijd van muizen verkorten of verlengen. Daarom wordt aanbevolen om voorafg...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken in het bijzonder de Santa Catarina State University voor financiële steun, het Farmacologielaboratorium voor de dieren en de ruimte, en het Hemoparasieten en Vectoren Biochemisch Laboratorium voor het ingevroren bloedmonster geïnfecteerd met T. evansi dat in deze experimenten werd gebruikt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 26 G 1/2" naald gekoppeld aan insulinesyringe | TKL | 80288090100 | Wordt gebruikt om oplossingen toe te dienen op laboratoriumdieren |
| Accessoires voor von Frey analgesimeter | INSIGHT | EFF 303 | Bevatningsbox met ondersteuning voor digitale analgesimeter beoordeling |
| D-(+)-Glucose | SIGMA-ALDRICH | G7021 | Een monosaccharide die de belangrijkste energiebron is in de vorm van ATP voor levende organismen |
| Digitaal analgesimeter | INSIGHT | von Frey Wi-Fi | De von Frey Wi-Fi is een draagbaar apparaat dat wordt gebruikt om de gevoeligheid van weefsels voor mechanische stimuli te beoordelen |
| Gilson type 10 µL polypropyleen tip | CRALPLAST | 18261 | Polypropyleen voor gebruik op elektronische von Frey apparaten, aanbevolen voor beoordeling van allodynie in de achterpoot |
| Laboratorium waterbad | BEING INSTRUMENT | BW-22P | Wordt gebruikt om vloeibare en halfvaste stoffen in geschikte recipiënten op een specifieke temperatuur te verwarmen |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | SIGMA-ALDRICH | 806552 | Een gebalanceerde zoutbufferoplossing die wordt gebruikt voor verschillende celkweektoepassingen |
| Zwitserse muizen (Mus musculus) van beide geslachten | UFSC | Swiss Webster | Laboratoriumdieren die worden gebruikt voor gecontroleerde experimenten |
| Trypanosoma evansi cryiobewaard monster | UDESC | - | Monster dat wordt gebruikt om alle muizen te infecteren, afgestaan door het Biochemie Laboratorium voor Hemoparasieten en Vectoren |
| Universele type 10 µL polypropyleen tip | CRALPLAST | 18171 | Polypropyleen voor gebruik op elektronische von Frey apparaten, aanbevolen voor beoordeling van viscerale allodynie |
Referenties
- Desquesnes, M., et al. Trypanosoma evansi and surra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects. BioMed Research International. 2013, 194176(2013).
- Cipriani, D. S., et al. Experimental Trypanosoma evansi infection induces pain along with oxidative stress, prevented by COX-2 inhibition. Experimental Parasitology. 247, 108477(2023).
- Paim, F. C., et al. Cytokines in rats experimentally infected with Trypanosoma evansi. Experimental Parasitology. 128 (4), 365-370 (2011).
- Gillingwater, K., et al. In vivo investigations of selected diamidine compounds against Trypanosoma evansi using a mouse model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 5074-5079 (2009).
- Dkhil, M. A., et al. Treatment of Trypanosoma evansi-infected mice with Eucalyptus camaldulensis led to a change in brain response and spleen immunomodulation. Frontiers in Microbiology. 13, 833520(2022).
- Dkhil, M. A., et al. Murine liver response to Allium sativum treatment during infection induced-trypanosomiasis. Saudi Journal of Biological Sciences. 28 (6), 3270-3274 (2021).
- Martins de Moraes, C., et al. Infection by Trypanosoma evansi in horses from Brazil. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. 102 (561-562), 159-163 (2007).
- Martinov, T., et al. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of Visualized Experiments. 82, e51212(2013).
- Rodríguez-Angulo, H., et al. Role of TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas' disease. Experimental Parasitology. 134 (4), 422-429 (2013).
- Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7, 447-449 (2010).
- Eijkelkamp, N., et al. Increased visceral sensitivity to capsaicin after DSS-induced colitis in mice: spinal cord c-Fos expression and behavior. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 293 (4), 749-757 (2007).
- Mekata, H., et al. Expression of regulatory dendritic cell-related cytokines in cattle experimentally infected with Trypanosoma evansi. Journal of Veterinary Medical Science. 77 (8), 1017-1019 (2015).
- Mukaka, M. M. Statistics corner: a guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Schober, P., et al. Correlation coefficients: appropriate use and interpretation. Anesthesia and Analgesia. 126 (5), 1763-1768 (2018).
- Kamidi, C. M., et al. Differential virulence of camel Trypanosoma evansi isolates in mice. Parasitology. 145 (9), 1235-1242 (2018).
- Mekata, H., et al. Isolation, cloning, and pathologic analysis of Trypanosoma evansi field isolates. Parasitology Research. 112, 1513-1521 (2013).
- Silva, A. S., et al. Trypanosoma evansi pathogenicity strain in rats inoculated with parasite in fresh and cryopreserved blood. Ciência Rural. 39 (6), 1842-1846 (2009).
- Silva, A. S., et al. Acetylcholinesterase activity and lipid peroxidation in the brain and spinal cord of rats infected with Trypanosoma evansi. Veterinary Parasitology. 175, 237-244 (2011).
- Diógenes, A. K. L., et al. Concurrent validity of electronic von Frey as an assessment tool for burn associated pain. Burns. 46 (6), 1328-1336 (2020).
- Kalueff, A. V., et al. Neurobiology of rodent self-grooming and its value for translational neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 17, 45-59 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
