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Articolo metodologico

Effetti del Desmodium caudatum sugli ormoni gastrointestinali e sulla flora intestinale nei ratti con gastrite

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DOI:

10.3791/65744

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1 marzo 2024

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1Key Laboratory for Quality Control and Evaluation of Traditional Chinese Medicine of Mianyang City, Mianyang Normal University, 2The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive il metodo per l'analisi della flora intestinale utilizzando il sequenziamento del gene rRNA 16S basato su Illumina e fornisce un quadro per valutare l'efficacia dei decotti a base di erbe.

Abstract

Al fine di esplorare preliminarmente gli effetti del Desmodium caudatum sulla gastrite e sulla flora intestinale nei ratti, è stato stabilito un modello di ratto con gastrite cronica utilizzando il classico metodo del salicilato di sodio. Diciotto ratti SPF sono stati divisi in tre gruppi: il gruppo di controllo (Gruppo C), il gruppo modello (Gruppo M) e il gruppo di trattamento (Gruppo T). Sezioni patologiche della parete gastrica sono state prelevate dai ratti di ciascun gruppo. Inoltre, le concentrazioni di gastrina e malondialdeide nel siero dei ratti di ciascun gruppo sono state determinate mediante ELISA. Inoltre, gli effetti di D. caudatum sulla flora intestinale dei ratti con gastrite sono stati esplorati attraverso un confronto dettagliato delle comunità batteriche intestinali nei tre gruppi, impiegando il sequenziamento del gene rRNA 16S basato su Illumina. I risultati hanno indicato che il decotto di D. caudatum potrebbe ridurre il contenuto di malondialdeide e aumentare il contenuto di gastrina. Inoltre, è stato scoperto che il decotto di D. caudatum migliora la diversità e l'abbondanza della flora intestinale, esercitando un impatto positivo sul trattamento della gastrite regolando e ripristinando la flora intestinale.

Introduzione

La gastrite cronica (CG), una delle malattie cliniche più comuni, è caratterizzata da alterazioni infiammatorie croniche e persistenti dell'epitelio della mucosa gastrica, che viene frequentemente e ripetutamente attaccato da vari fattori patogeni1. Il tasso di incidenza della CG è al primo posto tra tutti i tipi di malattie dello stomaco, rappresentando dal 40% al 60% del tasso di servizio ambulatoriale nel Dipartimento di Gastroenterologia2. Inoltre, il tasso di incidenza aumenta generalmente con l'età, soprattutto nei soggetti di mezza età e più anziani3. Indubbiamente, la CG riduce significativamente la qualità della vita delle persone, sottolineando la necessità critica di scoprire nuovi agenti terapeutici.

Numerosi studi hanno riportato che l'insorgenza e lo sviluppo di CG sono legati alla secrezione di ormoni gastrointestinali, come la gastrina (GAS)4,5. Il GAS, un comune ormone peptidico gastrointestinale nel tratto digestivo, stimola le cellule a secernere acido gastrico promuovendo il rilascio di istamina dagli eosinofili. Inoltre, migliora la nutrizione e l'afflusso di sangue della mucosa gastrica, favorendo la proliferazione della mucosa gastrica e delle cellule parietali6. Pertanto, la gastrina può essere utilizzata come indicatore per valutare il livello di sviluppo della CG. Inoltre, i prodotti di perossidazione lipidica innescati dagli ossidi reattivi possono attivare le cellule infiammatorie, portando alla CG. La malondialdeide (MDA), un marcatore della perossidazione lipidica, è un indicatore comunemente usato per misurare il grado di stress ossidativo. Riflette in una certa misura il livello di radicali liberi nella mucosa gastrica. Il livello di MDA può indicare l'attacco di acidi grassi insaturi nella mucosa gastrica locale causato dai radicali liberi 7,8.

La microecologia intestinale è costituita da milioni di microrganismi che risiedono nell'intestino dell'ospite, svolgendo un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute dell'ospite e nella regolazione dell'immunità dell'ospite. Una flora intestinale sana, caratterizzata da un'elevata ricchezza, diversità e funzione stabile del microbiota, funge da barriera protettiva contro l'invasione di microrganismi patogeni partecipando al metabolismo. I disturbi della flora intestinale rendono gli individui più suscettibili alle malattie gastrointestinali acute e croniche 9,10. Negli ultimi anni, la terapia del microbiota per le malattie gastrointestinali è progredita rapidamente e ha dimostrato un'efficacia significativa11. In sintesi, la considerazione della flora intestinale è fondamentale per comprendere e affrontare le malattie gastrointestinali.

Come componente indispensabile del tesoro della medicina tradizionale cinese, i materiali medicinali popolari hanno un grande significato per la pratica clinica e la modernizzazione della medicina nazionale. Le radici e le parti intere di Desmodium caudatum (Thunb.) DC. è stato ampiamente utilizzato per alleviare il disagio allo stomaco nell'area di Beichuan Qiang della città di Mianyang per un periodo prolungato. Alcuni articoli indicano le basi scientifiche per il trattamento delle malattie gastrointestinali con D. caudatum, citando i suoi effetti come l'emostasi, l'antiossidazione e la protezione gastrointestinale 12,13,14. Tuttavia, a causa della mancanza di ricerche approfondite, non è stato stabilito alcun meccanismo di farmacodinamica clinica. Questo articolo si propone di studiare gli effetti di D. caudatum nel trattamento della gastrite sulla base degli ormoni gastrointestinali e della flora intestinale, fornendo una base per la sua applicazione clinica razionale.

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Protocollo

Le procedure per la cura e l'uso degli animali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università Normale di Mianyang e sono state seguite rigorosamente tutte le normative istituzionali e governative pertinenti riguardanti l'uso etico degli animali. Per il presente studio sono stati utilizzati ratti SPF (specie Kunming, sia maschi che femmine, del peso di 180-220 g). Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Tutti gli animali sono stati alloggiati in un ambiente privo di agenti patogeni e hanno avuto accesso al cibo ad libitum .

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare una soluzione di salicilato di sodio al 5% pesando 2,5 g di polvere di salicilato di sodio (vedere Tabella dei materiali) con una bilancia elettronica. Sciogliere la polvere in una piccola quantità di acqua distillata e diluirla fino a un volume totale di 50 ml.
  2. Preparare il decotto di D. caudatum (12,8 g/kg). Pesare 128 g di D. caudatum (vedi Tabella dei materiali), metterlo in un matraccio a fondo tondo contenente 1000 ml di acqua distillata di laboratorio e concentrarlo fino a un volume finale di 100 ml.

2. Raggruppamento e amministrazione

  1. Dividere i ratti in diversi gruppi e somministrare per via intragastrica le soluzioni richieste.
    NOTA: Per il presente studio, 18 ratti (9 maschi, 9 femmine) sono stati divisi in tre gruppi: il gruppo di controllo (Gruppo C), il gruppo modello (Gruppo M) e il gruppo di trattamento (Gruppo T), con 6 ratti in ciascun gruppo. Il gruppo di controllo ha ricevuto una soluzione salina e il gruppo modello ha ricevuto una soluzione di salicilato di sodio al 5% per 5 settimane alla dose di 10 ml/kg/die15. Il gruppo di trattamento è stato pretrattato con una soluzione di salicilato di sodio al 5% per 5 settimane alla dose di 10 ml/kg/die, seguita dalla somministrazione del decotto di D. caudatum alla dose di 1 ml/100 g per 10 giorni15,16.
  2. Raccogliere le feci dei ratti in provette da microcentrifuga asciutte e sterili utilizzando il metodo di trasporto della coda17 l'ultimo giorno dell'esperimento e congelarle in un congelatore ad azoto liquido a bassissima temperatura.
  3. Al termine del prelievo, sacrificare i ratti mediante lussazione cervicale (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Aprire la cavità addominale con le forbici per esporre l'aorta addominale.
    1. Inserire l'ago (23-25 G) quasi parallelamente nell'aorta addominale, raccogliere il siero e conservarlo in un congelatore a bassissima temperatura. Estrarre lo stomaco dalla cavità addominale16 e immergerlo in una soluzione di formalina al 10% per la conservazione.
      NOTA: Nel gruppo M, il modello di gastrite cronica è considerato efficace se la mucosa gastrica è dilatata e congestionata con una morfologia ghiandolare regolare15, osservando una piccola quantità di infiltrazione di cellule infiammatorie nella lamina propria.

3. Sezione patologica della parete gastrica

  1. Prelevare i campioni della parete gastrica dai ratti di ciascun gruppo per le sezioni patologiche. Successivamente, eseguire la colorazione di routine con ematossilina-eosina per osservare e analizzare i cambiamenti patologici18.

4. Determinazione degli ormoni gastrointestinali sierici

  1. Nel campione di siero, rilevare il contenuto di gastrina (GAS) e malondialdeide (MDA)19 utilizzando ELISA seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare un lettore di micropiastre per l'analisi.

5. Estrazione del DNA totale fecale e amplificazione e purificazione PCR

  1. Eseguire l'estrazione del DNA microbico utilizzando il kit di isolamento del DNA disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) e determinare la concentrazione e la purezza utilizzando lo spettrofotometro UV-Vis16. Successivamente, valutare l'integrità del DNA attraverso l'elettroforesi su gel di agarosioall'1% 18.
  2. Amplificare il gene rRNA 16S dei batteri con primer 338F (5′-ACT, CCT, ACG, GGA, GGC, AGC, AGC, AG-3′) e 806R (5′-GAC, TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′) utilizzando un sistema PCR termociclatore17. I primer sono ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: Seguire il programma PCR: denaturazione (3 min, 95 °C), seguita da 27 cicli (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) e un'estensione finale (10 min, 72 °C). Condurre reazioni di PCR con i seguenti componenti: 4 μL di tampone DNA polimerasi al 5×, 2 μL di dNTP da 2,5 mM, 0,8 μL di ciascun primer (5 μM), 0,4 μL di DNA polimerasi e 10 ng di DNA stampo (vedi Tabella dei materiali).
  3. Estrarre, purificare e quantificare i prodotti PCR in sequenza utilizzando rispettivamente gel di agarosio al 2%, kit di estrazione di gel di DNA disponibile in commercio e fluorimetro17.

6. Sequenziamento

NOTA: I passaggi 6 e 7 vengono eseguiti seguendo i metodi20,21 pubblicati in precedenza.

  1. Utilizza la piattaforma Illumina per il sequenziamento.
    NOTA: Un'estremità del frammento di DNA completa la base del connettore incorporato nel chip, fissandolo al chip. L'altra estremità completa in modo casuale la base di un altro giunto sepolto adiacente, formando un "ponte".
  2. Eseguire l'amplificazione PCR per generare cluster di DNA. Linearizzare gli amplificatori del DNA in singoli filamenti.
  3. Introdurre una DNA polimerasi alterata insieme ai desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP) con quattro distinti marcatori fluorescenti. Sintetizzare una sola base per ciclo.
  4. Utilizzare un laser per scansionare la superficie della piastra di reazione e determinare i tipi di nucleotidi polimerizzati durante la reazione iniziale di ciascuna sequenza stampo.
  5. Scindere chimicamente il "gruppo di fluorescenza" e il "gruppo di terminazione" per ristabilire l'estremità appiccicosa da 3'. Successivamente, si passa alla polimerizzazione del secondo nucleotide.
  6. Ottenere la sequenza dei frammenti di DNA stampo analizzando i risultati del segnale di fluorescenza raccolti in ogni round.

7. Trattamento dei dati di sequenziamento

  1. Inizialmente, tagliare le letture dei dati fastq grezzi in qualsiasi sito con un punteggio < Q20 ed eliminare le letture con basi incerte. Inoltre, consente due discrepanze in primer abbinati con precisione. Successivamente, unire le sequenze con una sovrapposizione >10 bp.
  2. Raggruppare le unità tassonomiche operative (OTU) con una somiglianza del 97% utilizzando UPARSE e rimuovere le sequenze chimeriche con UCHIME20,21.
  3. Utilizzare l'algoritmo RDP Classifier per analizzare la tassonomia di ciascuna sequenza genica dell'rRNA 16S rispetto al database dell'rRNA 16S Silva (SSU123), utilizzando una soglia di confidenza del 70%.
  4. Eseguire l'analisi della diversità alfa e l'analisi della diversità beta utilizzando rispettivamente Mothur e Qiime (vedere la tabella dei materiali).

8. Analisi statistica

  1. Analizzare i dati di questo studio utilizzando un software di analisi statistica (vedi Tabella dei materiali). Impiega l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per i confronti tra più gruppi e utilizza il test della differenza minima significativa (LSD) per i confronti tra due gruppi.
  2. Si consideri P < 0,05 come statisticamente significativo in tutti i confronti. P < 0,01 è considerato estremamente significativo.

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Risultati

I risultati della sezione patologica della parete dello stomaco sono illustrati nella Figura 1. Rispetto al gruppo C, il gruppo M ha mostrato una lieve atrofia della parete gastrica e una lieve infiammazione. Tuttavia, rispetto al gruppo M, il gruppo T non ha mostrato infiammazioni, metaplasie intestinali o atrofia evidenti. Ciò suggerisce che il decotto di D. caudatum può migliorare efficacemente la gastrite.

I risultati del dosaggio dell'ormone gastroin...

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Discussione

D. caudatum, una medicina popolare comunemente usata dalla nazionalità Qiang12, ha mostrato un'efficacia significativa nel trattamento delle malattie gastrointestinali. Con il progresso della moderna ricerca farmacologica, lo squilibrio della flora derivante dallo squilibrio della microecologia gastrointestinale è identificato come un fattore chiave nelle malattie gastrointestinali acute e croniche22,23. Alcuni microrganismi nel t...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dai progetti chiave di ricerca e sviluppo del Dipartimento di scienza e tecnologia della provincia di Sichuan (2020YFS0539).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Analisi della diversità alfaMothur 1.30.2
Kit di estrazione su gel di acido desossiribonucleico (DNA) AxyPrep Axygen Biosciences AP-GX-50
Analisi della diversitàQiime 1.9.1
Frigorifero criogenicoForma-86C Congelatore
Desmodium caudatumL'ospedale di medicina tradizionale cinese di Beichuan Qiang Autonomous County
E.Z.N.A. kit suoloOmega Bio-tekD5625-01
Illumina MiSeq PlatformIllumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan Spectrespettrali Max i3
OTU clusteringUparse 7.0.1090
Statistiche OTUUsearch 7.0
Strumento PCRTransGen AP221-02
Strumento PCRABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST a doppio filamento sistema di DNA (dsDNA)Promega Corp.
Annotazione di classificazione della sequenzaRDP Classifier 2.11
Salicilato di sodioSichuan Xilong Chemical Co., Ltd54-21-7
RATTI SPFChengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0IBM
beta ULT

Riferimenti

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