تحديد نوع الألياف للعضلات الهيكلية البشرية

Summary

يوضح هذا البروتوكول عزل الألياف المفردة من العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد وتصنيف نوع الألياف وفقا لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) باستخدام تقنية النشاف النقطية. يمكن بعد ذلك تحليل عينات الألياف MHC I و II المحددة بشكل أكبر بحثا عن الاختلافات الخاصة بنوع الألياف في تعبير البروتين باستخدام النشاف الغربي.

Abstract

يمكن استخدام التقنية الموصوفة هنا لتحديد أشكال متماثلة محددة من سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) في أجزاء من ألياف العضلات الفردية باستخدام النشاف النقطي ، ويشار إليها فيما يلي باسم اكتشاف سلسلة الأوسينالثقيلة الخاصة بي بواسطة Dot Blotting لتحديد معرفنوع الألياف العضلية (MyDoBID). يصف هذا البروتوكول عملية تجفيف العضلات الهيكلية البشرية بالتجميد وعزل أجزاء من ألياف العضلات المفردة. باستخدام MyDoBID ، يتم تصنيف الألياف من النوع الأول والثاني مع الأجسام المضادة الخاصة ب MHCI و IIa ، على التوالي. ثم يتم دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف لكل خزعة.

يتم تحديد البروتين الكلي في كل عينة بواسطة الرحلان الكهربائي لثنائي الصوديوم – كبريتات بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) وتقنية الجل المنشط بالأشعة فوق البنفسجية. يتم التحقق من صحة نوع الألياف من العينات باستخدام النشاف الغربي. كما تم وصف أهمية إجراء تطبيع تحميل البروتين لتعزيز اكتشاف البروتين المستهدف عبر البقع الغربية المتعددة. تشمل فوائد دمج الألياف المصنفة في عينات خاصة بنوع الألياف مقارنة بالبقع الغربية أحادية الألياف ، تعدد استخدامات العينات ، وزيادة إنتاجية العينة ، واستثمار وقت أقصر ، وتدابير توفير التكاليف ، كل ذلك مع الاحتفاظ بمعلومات قيمة خاصة بنوع الألياف والتي غالبا ما يتم تجاهلها باستخدام عينات العضلات المتجانسة. الغرض من البروتوكول هو تحقيق تحديد دقيق وفعال للألياف من النوع الأول والنوع الثاني المعزولة من عينات العضلات الهيكلية البشرية المجففة بالتجميد.

يتم دمج هذه الألياف الفردية لاحقا لإنشاء عينات خاصة بنوع الألياف من النوع الأول والنوع الثاني. علاوة على ذلك ، تم توسيع البروتوكول ليشمل تحديد ألياف النوع IIx ، باستخدام الأكتين كعلامة للألياف التي كانت سلبية ل MHCI و MHCIIa ، والتي تم تأكيدها على أنها ألياف IIx بواسطة النشاف الغربي. ثم يتم استخدام كل عينة خاصة بنوع الألياف لتحديد التعبير عن البروتينات المستهدفة المختلفة باستخدام تقنيات النشاف الغربية.

Introduction

العضلات الهيكلية هي نسيج غير متجانس ، مع خصائص التمثيل الغذائي وانقباض الخلوية المتميزة التي تعتمد على ما إذا كانت الخلية (الألياف) هي نشل بطيء (النوع الأول) أو نشل سريع (النوع الثاني). يمكن التعرف على نوع الألياف من خلال فحص الأشكال المتساوية لسلسلة الميوسين الثقيلة (MHC) ، والتي تختلف عن بعضها البعض بعدة طرق ، بما في ذلك وقت الانكماش وسرعة التقصير ومقاومة التعب¹. تشمل الأشكال المتساوية الرئيسية MHC النوع الأول والنوع IIa والنوع IIb والنوع IIx وتكون ملامحها الأيضية إما مؤكسدة (النوع الأول و IIa) أو تحلل السكر (IIx ، IIb) ¹. تختلف نسبة أنواع الألياف هذه في نوع العضلات وبين الأنواع. تم العثور على النوع IIb على نطاق واسع في عضلات القوارض. لا تحتوي عضلات الإنسان على أي ألياف من النوع IIb وتتكون في الغالب من ألياف MHC من النوع الأول و IIa ، مع نسبة صغيرة من ألياف IIx². تختلف ملامح تعبير البروتين بين أنواع الألياف المختلفة ويمكن تغييرها مع الشيخوخة³ ، وممارسة⁴،^{5 ،} والمرض⁶.

غالبا ما يتم تجاهل قياس الاستجابات الخلوية في أنواع مختلفة من الألياف العضلية الهيكلية أو غير ممكن بسبب فحص تجانس العضلات (مزيج من جميع أنواع الألياف). تسمح اللطخة الغربية أحادية الألياف بفحص البروتينات المتعددة في ألياف العضلات الفردية⁷. تم استخدام هذه المنهجية سابقا لإنتاج خصائص ألياف مفردة جديدة وغنية بالمعلومات لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام مستحضرات متجانسة. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على منهجية اللطخة الغربية الأصلية أحادية الألياف ، بما في ذلك الطبيعة التي تستغرق وقتا طويلا ، وعدم القدرة على توليد نسخ متماثلة للعينات ، واستخدام كواشف التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) باهظة الثمن والحساسة. إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة ، فإن هذه الطريقة محدودة بشكل أكبر بسبب القيود الزمنية للحاجة إلى عزل الألياف الفردية في إطار زمني محدود (أي 1-2 ساعة). لحسن الحظ ، يتم تخفيف هذا التقييد عن طريق عزل شرائح الألياف المفردة من الأنسجة المجففة^{بالتجميد 8}. ومع ذلك ، فإن جمع الألياف من العينات المجففة بالتجميد محدود بحجم وجودة الأنسجة المأخوذة.

تم توضيح تحديد نوع الألياف باستخدام طريقة النشاف^{النقطي 9} بشكل كبير وتوسيعه في هذا البروتوكول الشامل. في السابق ، ثبت أن أقل من ~ 2-10 ملغ من الأنسجة العضلية ذات الوزن الرطب كافية للتجفيف بالتجميد وتحليل البروتين أحادي الألياف MHC⁹. استخدم Christensen et ^al.9 30٪ من قطعة ألياف ~ 1 مم للكشف عن شكل MHC الموجود عن طريق النشاف النقطي ، وهو ما أكده النشاف الغربي. أظهر هذا العمل أنه من خلال استبدال النشاف الغربي بالنشاف النقطي ، تم تخفيض التكاليف الإجمالية بمقدار ~ 40 ضعفا (ل 50 قطعة ألياف). ثم تم “تجميع” الألياف في عينات من النوع الأول والنوع الثاني ، مما سمح بالتكرار التجريبي⁹. ومع ذلك ، كان هناك قيد هو أنه تم الحصول على عينتين فقط من نوع الألياف: النوع الأول (MHCI إيجابي) والنوع الثاني (الألياف الإيجابية MHCII) ، مع عينات من النوع الثاني تحتوي على خليط من MHCIIa و MHCIIx ^6,10. والجدير بالذكر أن البروتوكول الحالي يوضح كيف يمكن تحديد الألياف النقية من النوع IIx ويوفر سير عمل مفصل للغاية (ملخص في الشكل 1) ، بما في ذلك استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمشكلات البروتوكول الشائعة.

Protocol

تم الحصول على عينات من العضلات البشرية من الأوعية الجانبية من n = 3 (2 ذكور ، 1 أنثى) ، تتراوح أعمارهم بين 70-74 سنة تحت ظروف معقمة باستخدام التخدير الموضعي (Xylocaine) وإبرة Bergstrom المعدلة للشفط اليدوي11،12. كانت العينات مجموعة فرعية من دراسة سابقة وافقت عليها لجنة أخلاق?…

Representative Results

تحديد الألياف العضلية الفردية MHCI و MHCIIa و MHCIIx باستخدام النشاف النقطيتتمثل إحدى ميزات MyDoBID في تصنيف شدة إشارة MHC و Actin المتغيرة في ألياف معينة (الشكل 4A). تم تحديد نوع الألياف من خلال وجود أو عدم وجود أشكال متماثلة MHCI و IIa (الشكل 4B). لم تظهر ستة ألياف أي ?…

Discussion

جمع الألياف
بناء على عدة سنوات من الخبرة ، يمكن لمعظم الباحثين إتقان هذه التقنية. ومع ذلك ، تؤدي الممارسة إلى جمع الألياف بشكل أسرع وأكثر كفاءة للتحليلات النهائية. لتكون قادرا على عزل 30 قطعة ألياف مفردة بجودة التجميع ، يوصى بجمع 50 قطعة ألياف لكل عينة. يوصى بدراسة فيديو جمع الأليا…

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.