זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

Summary

פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.

Abstract

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי לזהות איזופורמים ספציפיים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC) במקטעים של סיבי שריר בודדים באמצעות הכתמת נקודות, להלן זיהוי שרשרת כבדה של האוסין שליעל ידי Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייבוש בהקפאה של שרירי השלד האנושיים ובידוד מקטעים של סיבי שריר בודדים. באמצעות MyDoBID, סיבים מסוג I ו- II מסווגים עם נוגדנים ספציפיים MHCI ו- IIa, בהתאמה. סיבים מסווגים משולבים לאחר מכן לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים עבור כל ביופסיה.

סך החלבון בכל דגימה נקבע על ידי אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) וטכנולוגיית ג’ל המופעלת על ידי UV. סוג הדגימות של הסיבים מאומת באמצעות כתמים מערביים. מתוארת גם החשיבות של ביצוע נורמליזציה של העמסת חלבונים כדי לשפר את זיהוי חלבון המטרה על פני כתמים מערביים מרובים. היתרונות של איחוד סיבים מסווגים לדגימות ספציפיות לסוג סיבים בהשוואה לסיבים מערביים יחידים, כוללים רב-תכליתיות דגימה, תפוקת דגימה מוגברת, השקעה קצרה יותר בזמן ואמצעים לחיסכון בעלויות, כל זאת תוך שמירה על מידע יקר ערך ספציפי לסוג הסיב שלעתים קרובות מתעלמים ממנו באמצעות דגימות שריר הומוגניות. מטרת הפרוטוקול היא להשיג זיהוי מדויק ויעיל של סיבים מסוג I ו-II שבודדו מדגימות שרירי שלד אנושיים מיובשים בהקפאה.

סיבים בודדים אלה משולבים לאחר מכן ליצירת דגימות ספציפיות לסוג I וסוג II. יתר על כן, הפרוטוקול מורחב וכולל זיהוי של סיבים מסוג IIx, תוך שימוש באקטין כסמן לסיבים שהיו שליליים עבור MHCI ו- MHCIIa, אשר אושרו כסיבי IIx על ידי כתם מערבי. לאחר מכן משתמשים בכל דגימה ספציפית לסוג הסיב כדי לכמת את הביטוי של חלבוני מטרה שונים באמצעות טכניקות קרישה מערביות.

Introduction

שריר השלד הוא רקמה הטרוגנית, בעלת תכונות מטבוליות והתכווצות תאיות מובהקות התלויות בשאלה אם התא (סיבים) הוא עווית איטית (סוג I) או עווית מהירה (סוג II). ניתן לזהות את סוג הסיב על ידי בחינת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC), הנבדלים זה מזה במספר דרכים, כולל זמן התכווצות, מהירות הקיצור ועמידות בפני עייפות¹. איזופורמים עיקריים של MHC כוללים סוג I, סוג IIa, סוג IIb וסוג IIx והפרופילים המטבוליים שלהם הם חמצוניים (סוג I ו- IIa) או גליקוליטיים (IIx, IIb)¹. חלקם של סוגי סיבים אלה משתנה בסוג השריר ובין המינים. סוג IIb נמצא באופן נרחב בשרירי מכרסמים. שרירי האדם אינם מכילים סיבים מסוג IIb ומורכבים בעיקר מאיזופורמים מסוג MHC מסוג I ו- IIa, עם חלק קטן מסיבי IIx². פרופילי ביטוי החלבונים משתנים בין סוגי סיבים שונים, וניתן לשנות אותם עם הזדקנות³, פעילות גופנית ^4,5 ומחלה⁶.

לעתים קרובות מתעלמים או לא מאפשרים למדוד תגובות תאיות בסוגים שונים של סיבי שריר השלד בגלל בדיקת הומוגנטים של שרירים (שילוב של כל סוגי הסיבים). כתם מערבי חד-סיבתי מאפשר חקירה של חלבונים מרובים בסיבי שריר בודדים⁷. מתודולוגיה זו שימשה בעבר לייצור מאפיינים חדשניים ואינפורמטיביים של סיב בודד שלא ניתן היה להשיג באמצעות תכשירים הומוגניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות של המתודולוגיה המערבית המקורית של כתם סיב יחיד, כולל האופי הגוזל זמן, חוסר היכולת לייצר שכפול דגימות, והשימוש בריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) יקרים ורגישים. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, שיטה זו מוגבלת עוד יותר בשל אילוצי הזמן של הצורך לבודד סיבים בודדים במסגרת זמן מוגבלת (כלומר, 1-2 שעות). למרבה המזל, ריסון זה מתמתן על ידי בידוד מקטעים חד-סיביים מרקמה מיובשת בהקפאה⁸. עם זאת, איסוף סיבים מדגימות מיובשות בהקפאה מוגבל על ידי גודל ואיכות הרקמה הביופסית.

זיהוי סוג הסיבים בשיטת הכתמת נקודות⁹ הורחב והורחב באופן משמעותי בפרוטוקול מקיף זה. בעבר, הוכח כי מעט כמו ~ 2-10 מ”ג של רקמת שריר במשקל רטוב מספיק לייבוש בהקפאה וניתוח חלבון איזופורם MHC סיב יחיד⁹. Christensen et ^al.9 השתמשו ב-30% מקטע סיבים ~1 מ”מ כדי לזהות את איזופורם MHC הקיים על ידי כתם נקודה, אשר אושר על ידי כתם מערבי. עבודה זו הראתה כי על ידי החלפת כתם מערבי בכתמים נקודתיים, העלויות הכוללות הופחתו פי ~ 40 (עבור 50 מקטעי סיבים). לאחר מכן “אוגמו” סיבים לדגימות מסוג I ו-II, שאפשרו שכפול ניסיוני⁹. עם זאת, התקבלו רק שתי דגימות ספציפיות לסוג הסיבים: סוג I (MHCI חיובי) וסוג II (סיבים חיוביים MHCII), עם דגימות מסוג II המכילות תערובת של MHCIIa ו- MHCIIx ^6,10. יש לציין כי הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד ניתן לזהות סיבי IIx טהורים מסוג IIx ומספק זרימת עבודה מפורטת ביותר (המסוכמת באיור 1), כולל אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול.

Protocol

דגימות שריר אנושיות נלקחו מהווסטוס לטרליס מ n = 3 (2 גברים, 1 נקבה), בגילאי 70-74 שנים בתנאים סטריליים באמצעות הרדמה מקומית (Xylocaine) ומחט ברגסטרום שונה עבור יניקה ידנית11,12. הדגימות היו תת-קבוצה של מחקר קודם שאושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ויקטור?…

Representative Results

זיהוי סיבי שריר בודדים מסוג MHCI, MHCIIa ו-MHCIIx באמצעות כתם נקודותמאפיין של MyDoBID הוא סיווג של עוצמת האות MHC ו-Actin המשתנה בסיב נתון (איור 4A). סוג הסיבים זוהה על-ידי נוכחות או היעדר איזופורמים MHCI ו-IIa (איור 4B). שישה סיבים לא הראו זיהוי MHC או אקטין (actin), מה שמצביע…

Discussion

אוסף סיבים
בהתבסס על מספר שנות ניסיון, רוב החוקרים יכולים לשלוט בטכניקה זו; עם זאת, תרגול מוביל לאיסוף סיבים מהיר ויעיל יותר לניתוחים במורד הזרם. כדי שניתן יהיה לבודד 30 מקטעי סיבים בודדים באיכות לאיגום, מומלץ לאסוף 50 מקטעי סיבים בכל דגימה. מומלץ ללמוד היטב את סרטון איסוף הסיבים ו?…

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.