ヒト骨格筋の線維型同定

Summary

このプロトコルは、ドットブロッティング技術を使用して、ミオシン重鎖(MHC)アイソフォームに従って、凍結乾燥したヒト骨格筋および繊維タイプの分類からの単一繊維の分離を示しています。同定されたMHC IおよびIIファイバーサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して、タンパク質発現におけるファイバータイプ特異的な違いについてさらに分析することができます。

Abstract

ここで説明する技術は、ドットブロッティング(以下、筋線維タイプのIDエンティフィケーション(MyDoBID)のためのDot BロッティングによるMyosin重鎖検出と呼ぶドットブロッティングを用いて、個々の筋線維のセグメント中の特定のミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを同定するために用いることができる。このプロトコルは人間の骨格筋を凍結乾燥し、単一の筋繊維の区分を隔離するプロセスを記述する。MyDoBIDを用いて、I型線維とII型線維をそれぞれMHCI特異的抗体とIIa特異的抗体で分類します。次に、分類されたファイバーは、各生検のファイバータイプ固有のサンプルに結合されます。

各サンプル中の総タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびUV活性化ゲル技術によって決定されます。ファイバータイプのサンプルは、ウェスタンブロッティングを使用して検証されます。また、複数のウェスタンブロットで標的タンパク質の検出を強化するために、タンパク質ローディングの正規化を行うことの重要性についても説明します。単繊維ウェスタンブロットと比較して、分類された繊維を繊維タイプ固有のサンプルに統合する利点には、サンプルの多様性、サンプルスループットの向上、投資時間の短縮、コスト削減対策などがあり、均質化された筋肉サンプルでは見落とされがちな繊維タイプ固有の貴重な情報を保持します。プロトコルの目的は、凍結乾燥したヒト骨格筋サンプルから単離されたタイプIおよびタイプII繊維の正確かつ効率的な同定を達成することです。

その後、これらの個々の繊維を組み合わせて、タイプIおよびタイプIIの繊維タイプ固有のサンプルを作成します。さらに、MHCIおよびMHCIIaが陰性であった線維のマーカーとしてアクチンを使用し、ウェスタンブロッティングによってIIx線維として確認されたIIx型線維の同定を含むようにプロトコルを拡張しています。次に、各繊維タイプ固有のサンプルを使用して、ウェスタンブロッティング技術を使用してさまざまな標的タンパク質の発現を定量化します。

Introduction

骨格筋は不均一な組織であり、細胞(繊維)が遅筋(タイプI)か速筋(タイプII)かに依存する明確な細胞代謝および収縮特性を持っています。繊維の種類は、収縮時間、短縮速度、耐疲労性など、いくつかの点で互いに異なるミオシン重鎖(MHC)アイソフォームを調べることで識別できます¹。主なMHCアイソフォームには、I型、IIa型、IIb型、IIx型があり、それらの代謝プロファイルは酸化性(I型およびIIa型)または解糖系(IIx、IIb^{)のいずれか}です1。これらの繊維の種類の割合は、筋肉の種類や種によって異なります。IIb型はげっ歯類の筋肉に広く見られます。ヒトの筋肉にはIIb型線維は含まれておらず、主にMHCアイソフォームI型およびIIa線維で構成されており、IIx線維の割合はわずか^です2。タンパク質の発現プロファイルは繊維の種類によって異なり、加齢³、運動^4,5、疾患⁶によって変化する可能性があります。

異なる骨格筋線維タイプの細胞応答を測定することは、筋ホモジネート(すべての線維タイプの混合物)の検査のために見落とされたり、不可能になったりすることがよくあります。単繊維ウェスタンブロットは、個々の筋線維中の複数のタンパク質の調査を可能にします⁷。この方法論は、ホモジネート調製物では得られなかった新規で有益な単繊維特性を生み出すために以前に利用されてきました。しかし、当初のシングルファイバーウェスタンブロット法には、時間がかかること、サンプルの複製ができないこと、高価で高感度な化学発光(ECL)試薬の使用など、いくつかの限界がありました。新鮮な組織を使用する場合、この方法は、限られた時間枠(すなわち、1〜2時間)内に個々の繊維を単離する必要があるという時間的制約のためにさらに制限されます。幸いなことに、この拘束は、凍結乾燥組織から単線維セグメントを単離することによって緩和^{される8。}ただし、凍結乾燥サンプルからの繊維収集は、生検組織のサイズと品質によって制限されます。

ドットブロッティング法⁹を用いた繊維タイプの同定は、この包括的なプロトコルにおいて大幅に精緻化され、拡張された。以前、わずか2~10mgの湿潤重量の筋肉組織が凍結乾燥および単繊維MHCアイソフォームタンパク質分析に十分であることが実証されています⁹。Christensen et ^al.9 は、ドットブロッティングによって存在する MHC アイソフォームを検出するために、~1 mm のファイバーセグメントの 30% を使用し、これはウェスタンブロッティングによって確認されました。この研究では、ウェスタンブロッティングをドットブロッティングに置き換えることで、全体的なコストが~40倍削減されることが示されました(ファイバーセグメント50個分)。その後、繊維をタイプIおよびタイプIIのサンプルに「プール」し、実験^{的な複製を可能にし}た9。それにもかかわらず、限界は、タイプI(MHCI陽性)とタイプII(MHCII陽性繊維)の2つの繊維タイプ固有のサンプルしか得られず、タイプIIサンプルにはMHCIIaとMHCIIx^の混合物が含まれていることでした^6,10。特に、現在のプロトコルは、純粋なIIx型ファイバーの同定方法を示しており、一般的なプロトコルの問題に対するトラブルシューティング戦略を含む、非常に詳細なワークフロー(図1に要約)を提供しています。

Protocol

ヒトの筋肉サンプルは、局所麻酔(キシロカイン)と手動吸引用に改造されたバーグストローム針を使用した無菌条件下で70〜74歳のn = 3(男性2人、女性1人)の外側広筋から採取されました11,12。サンプルは、ビクトリア大学ヒト研究倫理委員会(HRETH11/221)によって承認され、ヘルシンキ宣言13に従って実施された以前の研究のサブセット…

Representative Results

ドットブロッティングを用いたMHCI、MHCIIa、MHCIIx筋線維の個体同定MyDoBIDの特徴は、特定のファイバー内のさまざまなMHCおよびアクチンシグナル強度を分類することです(図4A)。繊維の種類は、MHCIおよびIIaアイソフォームの有無によって識別されました(図4B)。6本のファイバーはMHCまたはアクチンの検出を示さず、ファイバーが回収さ?…

Discussion

繊維の収集
数年の経験に基づいて、ほとんどの研究者はこの手法を習得できます。しかし、実践することで、下流分析のためのファイバー収集をより迅速かつ効率的に行うことができます。プーリング用に品質の 30 本の単一ファイバーセグメントを分離できるようにするには、サンプルごとに 50 本のファイバーセグメントを収集することをお勧めします。妥当な基準を達成?…

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.