Fibertypsidentifiering av mänsklig skelettmuskulatur

Summary

Detta protokoll demonstrerar isolering av enstaka fibrer från frystorkad mänsklig skelettmuskulatur och fibertypsklassificering enligt isoform av Myosin heavy chain (MHC) med hjälp av dot blotting-tekniken. Identifierade MHC I- och II-fiberprover kan sedan analyseras ytterligare för fibertypsspecifika skillnader i proteinuttryck med hjälp av western blotting.

Abstract

Tekniken som beskrivs här kan användas för att identifiera specifika isoformer av tunga myosinkedjor (MHC) i segment av enskilda muskelfibrer med hjälp av punktblotting, hädanefter kallad Myosin heavy chain detection genom Dot B-lottningför ID-entifieringav muskelfibertyp (MyDoBID). Detta protokoll beskriver processen att frystorka mänsklig skelettmuskulatur och isolera segment av enstaka muskelfibrer. Med hjälp av MyDoBID klassificeras typ I- och II-fibrer med MHCI- respektive IIa-specifika antikroppar. Klassificerade fibrer kombineras sedan till fibertypspecifika prover för varje biopsi.

Det totala proteinet i varje prov bestäms av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och UV-aktiverad gelteknik. Fibertypen av prover valideras med hjälp av western blotting. Vikten av att utföra normalisering av proteinbelastning för att förbättra detektionen av målproteiner över flera västerländska fläckar beskrivs också. Fördelarna med att konsolidera klassificerade fibrer till fibertypsspecifika prover jämfört med enfiberiga western blots, inkluderar provmångsidighet, ökad provgenomströmning, kortare tidsinvestering och kostnadsbesparande åtgärder, samtidigt som värdefull fibertypspecifik information som ofta förbises med hjälp av homogeniserade muskelprover. Syftet med protokollet är att uppnå noggrann och effektiv identifiering av typ I- och typ II-fibrer isolerade från frystorkade mänskliga skelettmuskelprover.

Dessa enskilda fibrer kombineras sedan för att skapa typ I- och typ II-fibertypspecifika prover. Dessutom utvidgas protokollet till att omfatta identifiering av typ IIx-fibrer, med aktin som markör för fibrer som var negativa för MHCI och MHCIIa, vilka bekräftas som IIx-fibrer genom western blotting. Varje fibertypsspecifikt prov används sedan för att kvantifiera uttrycket av olika målproteiner med hjälp av western blotting-tekniker.

Introduction

Skelettmuskulatur är en heterogen vävnad, med distinkta cellulära metaboliska och kontraktila egenskaper som är beroende av om cellen (fibern) är långsam ryckning (typ I) eller snabb ryckning (typ II). Fibertypen kan identifieras genom att undersöka isoformerna av myosin tung kedja (MHC), som skiljer sig från varandra på flera sätt, inklusive kontraktionstid, förkortningshastighet och utmattningsbeständighet¹. Viktiga MHC-isoformer inkluderar typ I, typ IIa, typ IIb och typ IIx och deras metaboliska profiler är antingen oxidativa (typ I och IIa) eller glykolytiska (IIx, IIb)¹. Andelen av dessa fibertyper varierar i muskeltyp och mellan arter. Typ IIb finns ofta i gnagarmuskulaturen. Mänskliga muskler innehåller inga typ IIb-fibrer och består huvudsakligen av MHC-isoformer typ I- och IIa-fibrer, med en liten andel IIx-fibrer². Proteinuttrycksprofilerna varierar mellan olika fibertyper och kan förändras^{med 3 års} ålder, träning ^4,5 och sjukdom⁶.

Att mäta cellulära svar i olika typer av skelettmuskelfibrer förbises ofta eller är inte möjligt på grund av undersökningen av muskelhomogenat (en blandning av alla fibertyper). Enkelfibervästlig fläck gör det möjligt att undersöka flera proteiner i enskilda muskelfibrer⁷. Denna metodik har tidigare använts för att producera nya och informativa enkelfiberegenskaper som inte var möjliga att erhålla med homogena preparat. Det finns dock vissa begränsningar med den ursprungliga enkelfiber-western blot-metoden, inklusive den tidskrävande karaktären, oförmågan att generera provreplikat och användningen av dyra, känsliga ECL-reagenser (Enhanced Chemiluminescence). Om färsk vävnad används är denna metod ytterligare begränsad på grund av tidsbegränsningarna för att behöva isolera enskilda fibrer inom en begränsad tidsram (dvs. 1-2 timmar). Lyckligtvis mildras denna återhållsamhet genom att isolera enfibersegment från frystorkad vävnad⁸. Fiberinsamlingen från frystorkade prover begränsas dock av storleken och kvaliteten på den biopsierade vävnaden.

Identifiering av fibertyp med hjälp av dot blotting-metoden⁹ har utvecklats avsevärt och utökats i detta omfattande protokoll. Tidigare har det visats att så lite som ~2-10 mg våt muskelvävnad är tillräcklig för frystorkning och enfiberig MHC-isoformproteinanalys⁹. Christensen et ^al.9 använde 30 % av ett ~1 mm fibersegment för att detektera MHC-isoformen som finns vid punktblotting, vilket bekräftades genom western blotting. Detta arbete visade att genom att ersätta western blotting med dot blotting minskade de totala kostnaderna med ~40 gånger (för 50 fibersegment). Fibrerna “poolades” sedan i typ I- och typ II-prover, vilket möjliggjorde experimentell replikering⁹. En begränsning var dock att endast två fibertypsspecifika prover erhölls: typ I (MHCI-positiva) och typ II (MHCII-positiva fibrer), med typ II-prover som innehöll en blandning av MHCIIa och MHCIIx ^6,10. Det nuvarande protokollet visar hur rena typ IIx-fibrer kan identifieras och ger ett mycket detaljerat arbetsflöde (sammanfattat i figur 1), inklusive felsökningsstrategier för vanliga protokollproblem.

Protocol

Humana muskelprover erhölls från vastus lateralis från n = 3 (2 hanar, 1 kvinna), i åldern 70-74 år under sterila förhållanden med lokalbedövning (Xylocaine) och en Bergstrom-nål modifierad för manuell sugning11,12. Proverna var en delmängd av en tidigare studie som godkänts av Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) och genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen13. Deltagarna gav sk…

Representative Results

Identifiering av individuella MHCI-, MHCIIa- och MHCIIx-muskelfibrer med hjälp av dot blottingEn egenskap hos MyDoBID är kategoriseringen av den varierande MHC- och aktinsignalintensiteten i en given fiber (figur 4A). Fibertypen identifierades genom närvaron eller frånvaron av MHCI- och IIa-isoformer (figur 4B). Sex fibrer visade ingen MHC- eller aktindetektion, vilket indikerar att det inte fanns någon fiber insamlad. Resultaten av den…

Discussion

Insamling av fibrer
Baserat på flera års erfarenhet kan de flesta forskare behärska denna teknik; Övning leder dock till snabbare och effektivare fiberinsamling för nedströmsanalyser. För att kunna isolera 30 enkelfibersegment av en kvalitet för poolning, rekommenderas att 50 fibersegment samlas in per prov. Att studera fiberinsamlingsvideon noggrant och efter att ha utfört två övningssessioner (~50 fibrer per session) rekommenderas för att uppnå en rimlig standard. Alla fibrer som samlas…

Materials

1x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies	1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer	Make according to recipe	Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors	3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol can be sourced from any company	Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	A2066	Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales	Mettler Toledo	Model number: MSZ042101
Antibody enhancer	Thermo Fischer Scientific	32110	Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL)	N/A	N/A
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5452	Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever	Bio-Rad Laboratories	4560000	Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Model number: Universal hood III	Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (enhanced chemiluminescence)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick	Whatmann	3030917	Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps	Dumont	F6521-1EA	Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid	N/A	N/A	Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers	1653320	Bio-Rad	Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp	N/A	N/A
Magnetic stirrer with flea	N/A	N/A
Membrane roller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice.
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Mouse IgG HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31430	Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody	DSHB	A4.840	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody	DSHB	A4.74	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody	DSHB	6H1	Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm	Bio-Rad Laboratories	1620115	For Western blotting.
Petri dish lid	N/A	N/A
Plastic tweezers	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Product name: Basic power supply.
Protein ladder	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secondary	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker	N/A	N/A
Ruler	N/A	N/A
Scissors	N/A	N/A
Stereomicroscope	Motic	SMZ-168
Stripping buffer	Thermo Fisher Scientific	21059	Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free)	Kimberly-Clark professional	34120	Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol)	TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck	TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018	dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray	Bio-Rad Laboratories	1704089
UV-activation precast gel	Bio-Rad Laboratories	5678085	Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	BIOA0027-4L	1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers	Sistema	Store bought	Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.