Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, das eine In-vitro-Bewertung der Häufigkeit von fluoreszenzmarkierten microRNAs ermöglicht, um die Dynamik der microRNA-Verpackung und des Exports in extrazelluläre Vesikel (EVs) zu untersuchen.
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Vermittler der zellulären Kommunikation, die von einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen abgesondert werden. Diese EVs transportieren bioaktive Moleküle, einschließlich Proteine, Lipide und Nukleinsäuren (DNA, mRNAs, microRNAs und andere nicht-kodierende RNAs), von einer Zelle zur anderen, was zu phänotypischen Folgen in den Empfängerzellen führt. Von all den verschiedenen EV-Ladungen haben microRNAs (miRNAs) aufgrund ihrer eindeutigen Dysregulation und Häufigkeit in EVs viel Aufmerksamkeit für ihre Rolle bei der Gestaltung der Mikroumgebung und bei der Bildung von Empfängerzellen auf sich gezogen. Weitere Daten deuten darauf hin, dass viele miRNAs aktiv in EVs geladen werden. Trotz dieser eindeutigen Beweise ist die Forschung über die Dynamik des Exports und die Mechanismen der miRNA-Sortierung begrenzt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die durchflusszytometrische Analyse von EV-miRNA verwendet, um die Dynamik der EV-miRNA-Beladung zu verstehen und die am miRNA-Export beteiligten Maschinen zu identifizieren. In diesem Protokoll werden miRNAs, die in EVs angereichert und aus Spenderzellen abgereichert sind, an ein Fluorophor konjugiert und in die Spenderzellen transfiziert. Die fluoreszenzmarkierten miRNAs werden dann mittels qRT-PCR auf das Laden in EVs und die Depletion aus den Zellen überprüft. Sowohl als Transfektionskontrolle als auch als Werkzeug zum Gating der transfizierten Zellpopulation ist eine fluoreszenzmarkierte zelluläre RNA (zellretiniert und EV-depleted) enthalten. Zellen, die sowohl mit der EV-miRNA als auch mit der zellretinierten miRNA transfiziert wurden, werden über einen Zeitraum von 72 h auf Fluoreszenzsignale untersucht. Die für die EV-miRNAs spezifische Fluoreszenzsignalintensität nimmt im Vergleich zur zellretinierten miRNA rapide ab. Mit diesem einfachen Protokoll konnte man nun die Dynamik der miRNA-Beladung beurteilen und verschiedene Faktoren identifizieren, die für das Laden von miRNAs in Elektrofahrzeuge verantwortlich sind.
MicroRNAs (miRNAs) sind eine der am besten charakterisierten Untergruppen kleiner nicht-kodierender RNAs, die für ihre entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Genregulation bekannt sind. Die Expression und Biogenese der meisten miRNAs folgt einer koordinierten Abfolge von Ereignissen, die mit der Transkription der primären miRNAs (pri-miRNAs) im Zellkern beginnt. Nach der Kernprozessierung durch den Mikroprozessorkomplex zu Vorläufer-miRNAs (Prä-miRNAs) werden die Prä-miRNAs in das Zytoplasma exportiert, wo sie von der RNase-III-Endonuklease weiterverarbeitet werden, die zu 21-23 nukleotidreifen miRNA-Duplexen verarbeitet wird1. Einer der Stränge der prozessierten reifen miRNA bindet an Zielboten-RNAs (mRNAs), was zu einem Abbau oder einer translationalen Repression der Ziele führt2. Basierend auf der pleiotropen Rolle von miRNAs bei der gleichzeitigen Regulation mehrerer verschiedener Ziel-mRNAs ist es nicht verwunderlich, dass die miRNA-Expression streng reguliert ist3. In der Tat trägt eine unangemessene Expression zu verschiedenen Krankheitszuständen bei, insbesondere bei Krebs. Die aberrante Expression von miRNAs stellt nicht nur eine krankheitsspezifische Signatur dar, sondern hat sich auch als Ziel für prognostische und therapeutische Potenziale herauskristallisiert 4,5,6. Zusätzlich zu ihren intrazellulären Rollen haben miRNAs auch nicht-autonome Rollen. Zum Beispiel können miRNAs von Spenderzellen selektiv in EVs verpackt und an Empfängerstellen exportiert werden, wo sie verschiedene phänotypische Reaktionen in der normalen und krankheitsphysiologischen Physiologie hervorrufen 7,8,9.
Trotz eindeutiger Beweise dafür, dass EV-assoziierte miRNAs funktionelle Biomoleküle sind, ist nicht vollständig verstanden, wie bestimmte Untergruppen von miRNAs in Krankheitszuständen wie Krebs fehlreguliert sind und wie die zelluläre Maschinerie miRNAs selektiert und in Evs10,11 sortiert. Angesichts der potenziellen Rolle von EV-miRNAs bei der Modulation der Mikroumgebung ist es von entscheidender Bedeutung, die Mechanismen zu identifizieren, die am Export ausgewählter miRNAs beteiligt sind, um die Rolle von EVs in der interzellulären Kommunikation und der Krankheitspathogenese vollständig aufzuklären. Das Verständnis des Prozesses der miRNA-Freisetzung in EVs wird nicht nur wichtige Mediatoren des miRNA-Exports hervorheben, sondern kann auch Einblicke in potenzielle Therapeutika geben. Um diesen Wissensstand zu erreichen, müssen die Werkzeuge angepasst werden, um diese neuen experimentellen Fragen getreu zu beantworten. In der Tat nehmen Studien, die Elektrofahrzeuge bewerten, aufgrund der Einführung neuer Techniken und Kontrollen exponentiell zu12,13. In Bezug auf die Bewertung der Häufigkeit von exportierten miRNAs in EVs sind die Sequenzierung der nächsten Generation und die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) die aktuellen Standardwerkzeuge. Diese Werkzeuge sind zwar nützlich, um die Häufigkeit von miRNAs in Elektrofahrzeugen zu bewerten, aber es gibt Einschränkungen in Bezug auf ihre Sensitivität und Spezifität, und die Verwendung dieser statischen Ansätze zur Bewertung der Dynamik ist unzureichend. Um die Dynamik des miRNA-Exports in Elektrofahrzeuge zu beschreiben, ist eine Kombination spezialisierter Werkzeuge erforderlich. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, das fluoreszenzkonjugierte miRNAs verwendet, um die Dynamik der miRNA-Freisetzung aus Spenderzellen und des Einbaus in EVs zu analysieren. Außerdem gehen wir auf die Vorteile und Grenzen der Methode ein und geben Empfehlungen für den optimalen Einsatz. Die vielseitige Methode, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird für Forscher nützlich sein, die daran interessiert sind, die miRNA-Freisetzung in EVs und ihre potenzielle Rolle bei zellulärer Kommunikation und Krankheiten zu untersuchen.
Das neu etablierte Protokoll ermöglicht es, die Kinetik der miRNA-Freisetzung in EVs nach der Transfektion von EV-miRNAs zu erfassen. Der Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer EV-miRNAs und Zell-miRNAs, abhängig von den Fähigkeiten des Zytometers. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie zwar wertvolle Einblicke in die Biologie von EV-miRNAs liefern, ist aber nicht ohne Einschränkungen. Einige der Einschränkungen können jedoch überwunden werden, wenn sie in Verbindung mit anderen Techniken fü…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Jill Hutchcroft, Direktorin der Flow Cytometry Core Facility an der Purdue University, für die Unterstützung und den Rat. Diese Arbeit wurde von R01CA226259 und R01CA205420 an A.L.K., einem American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 an A.L.K., einem Purdue Shared Resource Facility Grant P30CA023168 und einem Flaggschiff-Fulbright-Promotionsstipendium unterstützt, das vom Department of the State, USA, an S.H.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
Ultracentrifuge | N/A | N/A |