ट्रैकिंग miRNA प्रवाह Cytometry का उपयोग Extracellular vesicles में रिलीज
Summary
यहां, हम एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो माइक्रोआरएनए पैकेजिंग की गतिशीलता का अध्ययन करने और बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) में निर्यात करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइक्रोआरएनए की प्रचुरता के इन विट्रो मूल्यांकन में सक्षम बनाता है।
Abstract
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) सेलुलर संचार के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं जो विभिन्न कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं। ये ईवीएस प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड (डीएनए, एमआरएनए, माइक्रोआरएनए और अन्य नॉनकोडिंग आरएनए) सहित बायोएक्टिव अणुओं को एक सेल से दूसरे सेल में शटल करते हैं, जिससे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में फेनोटाइपिक परिणाम होते हैं। सभी विभिन्न ईवी कार्गो में से, माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) ने माइक्रोएन्वायरमेंट को आकार देने और ईवीएस में उनके स्पष्ट डिसरेग्यूलेशन और बहुतायत के कारण प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को शिक्षित करने में उनकी भूमिका के लिए बहुत अधिक ध्यान आकर्षित किया है। अतिरिक्त डेटा इंगित करता है कि कई miRNAs सक्रिय रूप से EVs में भरी हुई हैं. इस स्पष्ट सबूत के बावजूद, निर्यात और miRNA छँटाई के तंत्र की गतिशीलता पर अनुसंधान सीमित है. यहाँ, हम EV-miRNA लोड हो रहा है की गतिशीलता को समझने और miRNA निर्यात में शामिल मशीनरी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि EV-miRNA के प्रवाह cytometry विश्लेषण का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, miRNAs पूर्व निर्धारित ईवीएस में समृद्ध और दाता कोशिकाओं से समाप्त एक फ्लोरोफोर के लिए संयुग्मित और दाता कोशिकाओं में transfected हैं. फ्लोरोसेंटली टैग miRNAs तो QRT-पीसीआर का उपयोग कर कोशिकाओं से EVs और कमी में लोड हो रहा है के लिए सत्यापित कर रहे हैं. दोनों एक अभिकर्मक नियंत्रण और कोशिकाओं के ट्रांसफ़ेक्ट आबादी gating के लिए एक उपकरण के रूप में, एक फ्लोरोसेंटली लेबल सेलुलर शाही सेना (सेल बनाए रखा और EV समाप्त) शामिल है. EV-miRNA और सेल बनाए रखा miRNA दोनों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 72 घंटे के पाठ्यक्रम पर फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. EV-miRNAs के लिए विशिष्ट प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता सेल बनाए रखा miRNA की तुलना में तेजी से कम हो जाती है. इस सीधा प्रोटोकॉल का प्रयोग, एक अब miRNA लोड हो रहा है की गतिशीलता का आकलन और ईवीएस में miRNAs लोड हो रहा है के लिए जिम्मेदार विभिन्न कारकों की पहचान सकता है.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) छोटे नॉनकोडिंग RNAs के सर्वोत्तम-विशेषता वाले सबसेट में से एक हैं, जो पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाने जाते हैं। अभिव्यक्ति और सबसे miRNAs के biogenesis नाभिक में प्राथमिक miRNAs (pri-miRNAs) के प्रतिलेखन के साथ शुरू होता है कि घटनाओं की एक समन्वित श्रृंखला का पालन करें. अग्रदूत-miRNAs (पूर्व miRNAs) में माइक्रोप्रोसेसर परिसर द्वारा परमाणु प्रसंस्करण के बाद, पूर्व miRNAs वे RNase III endonuclease, 21-23 न्यूक्लियोटाइड परिपक्व miRNA डुप्लेक्स 1 में डाइसर द्वारा आगे प्रसंस्करण से गुजरना जहां साइटोप्लाज्म को निर्यात कर रहेहैं. संसाधित परिपक्व miRNA के किस्में में से एक लक्ष्य2 के गिरावट या translational दमन के लिए अग्रणी, दूत RNAs (mRNAs) को लक्षित करने के लिए बांधता है. एक साथ कई विविध लक्ष्य mRNAs को विनियमित करने में miRNAs के pleiotropic भूमिका के आधार पर, यह miRNA अभिव्यक्ति कसकर3 विनियमित है कि आश्चर्य की बात नहीं है. दरअसल, अनुचित अभिव्यक्ति विभिन्न रोग राज्यों में योगदान देती है, खासकर कैंसर में। miRNAs की aberrant अभिव्यक्ति न केवल एक रोग विशिष्ट हस्ताक्षर का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह भी रोगनिरोधी और चिकित्सीय क्षमता 4,5,6 के लिए एक लक्ष्य के रूप में उभरा है. उनके intracellular भूमिकाओं के अलावा, miRNAs भी गैर स्वायत्त भूमिकाएं हैं. उदाहरण के लिए, miRNAs चुनिंदा दाता कोशिकाओं द्वारा EVs में पैक किया जा सकता है और वे सामान्य और रोग शरीर क्रिया विज्ञान 7,8,9 में विविध फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाओं प्रकाश प्राप्त जहां प्राप्तकर्ता साइटों के लिए निर्यात किया.
स्पष्ट सबूत है कि ईवी जुड़े miRNAs कार्यात्मक biomolecules हैं, यह पूरी तरह से कैसे miRNAs के विशिष्ट subsets कैंसर के रूप में रोग राज्यों में disregulated हैं और कैसे सेलुलर मशीनरी का चयन करता है और Evs10,11 में miRNAs सॉर्ट कर रहे हैं समझ में नहीं आता है. microenvironment modulating में EV-miRNAs की संभावित भूमिका को देखते हुए, यह पूरी तरह से अंतरकोशिकीय संचार और रोग रोगजनन में EVs की भूमिका स्पष्ट करने के लिए चुनिंदा miRNAs के निर्यात में शामिल तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. ईवीएस में miRNA रिलीज की प्रक्रिया को समझना न केवल miRNA निर्यात के महत्वपूर्ण मध्यस्थों को उजागर करेगा, लेकिन यह भी संभावित चिकित्सा विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. ज्ञान के इस स्तर को प्राप्त करने के लिए, उपकरणों ईमानदारी से इन नए प्रयोगात्मक सवालों को संबोधित करने के लिए अनुकूलित किया जा करने की जरूरत है. दरअसल, ईवीएस का मूल्यांकन करने वाले अध्ययन नई तकनीकों औरनियंत्रणों की शुरूआत के कारण तेजी से बढ़ रहे हैं 12,13. ईवीएस में निर्यात miRNAs की बहुतायत का मूल्यांकन करने के संबंध में, अगली पीढ़ी अनुक्रमण और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-पीसीआर) वर्तमान मानक उपकरण किया गया है. इन उपकरणों EVs में miRNAs की बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी होते हैं, उनकी संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए सीमाएं हैं, और गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इन स्थिर दृष्टिकोण का उपयोग अपर्याप्त है. ईवीएस में miRNA निर्यात की गतिशीलता को चित्रित करने के लिए विशेष उपकरणों के संयोजन की आवश्यकता होती है। यहाँ, हम fluorescently संयुग्मित miRNAs का उपयोग कर एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, दाता कोशिकाओं से miRNA रिलीज की गतिशीलता का विश्लेषण करने और EVs में निगमन करने के लिए. हम विधि के फायदे और सीमाओं पर भी चर्चा करते हैं और इष्टतम उपयोग के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं। बहुमुखी विधि इस पत्र में प्रस्तुत ईवीएस और सेलुलर संचार और रोग में उनकी संभावित भूमिकाओं में miRNA रिलीज का अध्ययन करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
नव स्थापित प्रोटोकॉल ईवीएस EVs EV-miRNAs के अभिकर्मक अभिकर्मक में miRNA रिलीज के कैनेटीक्स पर कब्जा करने में सक्षम बनाता है. दृष्टिकोण साइटोमीटर की क्षमताओं के अधीन कई EV-miRNAs और सेल-miRNAs के एक साथ विश्लेषण की अनुमति द?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पर्ड्यू विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा के निदेशक डॉ जिल हचक्रॉफ्ट से समर्थन और सलाह स्वीकार करते हैं। इस काम को R01CA226259 और R01CA205420 द्वारा समर्थित किया गया था एएलके, एक अमेरिकन लंग एसोसिएशन इनोवेशन अवार्ड (ANALA2023) IA-1059916 से ALK, एक पर्ड्यू साझा संसाधन सुविधा अनुदान P30CA023168, और एक प्रमुख फुलब्राइट डॉक्टरेट छात्रवृत्ति राज्य विभाग, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा एचएच को सम्मानित किया गया।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
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