Sporing av miRNA-frigjøring i ekstracellulære vesikler ved bruk av flowcytometri
Summary
Her beskriver vi en enkel protokoll som muliggjør in vitro-vurdering av overflod av fluorescerende merkede mikroRNA for å studere dynamikken til mikroRNA-emballasje og eksport til ekstracellulære vesikler (EV).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) er viktige mediatorer for cellulær kommunikasjon som utskilles av en rekke forskjellige celler. Disse EVene transporterer bioaktive molekyler, inkludert proteiner, lipider og nukleinsyrer (DNA, mRNA, mikroRNA og andre ikke-kodende RNAer), fra en celle til en annen, noe som fører til fenotypiske konsekvenser i mottakercellene. Av alle de forskjellige EV-lastene har mikroRNA (miRNA) fått stor oppmerksomhet for sin rolle i å forme mikromiljøet og utdanne mottakerceller på grunn av deres klare dysregulering og overflod i EV. Ytterligere data indikerer at mange miRNA er aktivt lastet inn i elbiler. Til tross for dette klare beviset er forskning på dynamikken i eksport og mekanismer for miRNA-sortering begrenset. Her gir vi en protokoll ved hjelp av flowcytometrianalyse av EV-miRNA som kan brukes til å forstå dynamikken til EV-miRNA-lasting og identifisere maskineriet som er involvert i miRNA-eksport. I denne protokollen blir miRNA som er forhåndsbestemt til å bli beriket i EV og utarmet fra donorceller, konjugert til en fluorofor og transfektet inn i donorcellene. De fluorescerende merkede miRNAene blir deretter verifisert for lasting i EV og uttømming fra celler ved hjelp av qRT-PCR. Som både en transfeksjonskontroll og et verktøy for gating av den transfekterte populasjonen av celler, er et fluorescerende merket cellulært RNA (cellebeholdt og EV-utarmet) inkludert. Celler transfeksjonert med både EV-miRNA og cellebeholdt miRNA evalueres for fluorescerende signaler i løpet av 72 timer. Fluorescenssignalintensiteten som er spesifikk for EV-miRNAene, reduseres raskt sammenlignet med det cellebeholdte miRNA. Ved hjelp av denne enkle protokollen kunne man nå vurdere dynamikken til miRNA-lasting og identifisere ulike faktorer som er ansvarlige for lasting av miRNA i elbiler.
Introduction
MikroRNA (miRNA) er en av de best karakteriserte delmengdene av små ikke-kodende RNAer, som er kjent for sin kritiske rolle i posttranskripsjonell genregulering. Ekspresjonen og biogenesen til de fleste miRNA følger en koordinert serie hendelser som begynner med transkripsjon av de primære miRNAene (pri-miRNAer) i kjernen. Etter kjernefysisk prosessering av mikroprosessorkomplekset til forløper-miRNA (pre-miRNAer), eksporteres pre-miRNAene til cytoplasma, hvor de gjennomgår videre prosessering av RNase III endonuclease, dicer i 21-23 nukleotid modne miRNA duplekser1. En av strengene i det behandlede modne miRNA binder seg til målbringer-RNA (mRNA), noe som fører til nedbrytning eller translasjonell undertrykkelse av målene2. Basert på den pleiotropiske rollen til miRNA i samtidig regulering av flere forskjellige mål-mRNAer, er det ikke overraskende at miRNA-uttrykk er tett regulert3. Faktisk bidrar upassende uttrykk til ulike sykdomstilstander, spesielt i kreft. Det avvikende uttrykket av miRNA representerer ikke bare en sykdomsspesifikk signatur, men har også dukket opp som et mål for prognostisk og terapeutisk potensial 4,5,6. I tillegg til deres intracellulære roller har miRNA også ikke-autonome roller. For eksempel kan miRNA selektivt pakkes inn i EV av donorceller og eksporteres til mottakersteder der de fremkaller forskjellige fenotypiske responser i normal og sykdomsfysiologi 7,8,9.
Til tross for klare bevis på at EV-assosierte miRNA er funksjonelle biomolekyler, er det ikke helt forstått hvordan spesifikke delmengder av miRNA er dysregulert i sykdomstilstander som kreft og hvordan cellulært maskineri velger og sorterer miRNA i Evs10,11. Gitt den potensielle rollen som EV-miRNA i modulering av mikromiljøet, er det avgjørende å identifisere mekanismene som er involvert i eksport av utvalgte miRNA for fullt ut å belyse EVs rolle i intercellulær kommunikasjon og sykdomspatogenese. Å forstå prosessen med miRNA-frigjøring i elbiler vil ikke bare fremheve viktige mediatorer for miRNA-eksport, men kan også gi innsikt i potensielle terapier. For å oppnå dette kunnskapsnivået må verktøyene tilpasses for å trofast adressere disse nye eksperimentelle spørsmålene. Faktisk vokser studier som evaluerer elbiler eksponentielt på grunn av introduksjonen av nye teknikker og kontroller12,13. I forhold til evaluering av overflod av eksporterte miRNA til EV, har neste generasjons sekvensering og kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) vært dagens standardverktøy. Selv om disse verktøyene er nyttige for å evaluere overflod av miRNA i EV, er det begrensninger i deres følsomhet og spesifisitet, og bruk av disse statiske tilnærmingene for å evaluere dynamikk er utilstrekkelig. Å avgrense dynamikken i miRNA-eksport til elbiler krever en kombinasjon av spesialiserte verktøy. Her presenterer vi en omfattende protokoll ved hjelp av fluorescerende konjugerte miRNAer, for å analysere dynamikken i miRNA-frigjøring fra donorceller og inkorporering i EV. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger ved metoden og gir anbefalinger for optimal bruk. Den allsidige metoden som presenteres i dette papiret, vil være nyttig for forskere som er interessert i å studere miRNA-utslipp til EV og deres potensielle roller i cellulær kommunikasjon og sykdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nyetablerte protokollen gjør det mulig å fange kinetikk av miRNA-frigjøring til EV-er etter transfeksjon av EV-miRNA. Tilnærmingen tillater samtidig analyse av flere EV-miRNA og celle-miRNAer, underlagt cytometerets evner. Dessuten, mens flowcytometrianalyse kan gi verdifull innsikt i EV miRNA-biologi, er det ikke uten begrensninger. Selv om noen av begrensningene kan overvinnes når de brukes sammen med andre teknikker for en mer omfattende forståelse.
Et fremvoksende interesseområ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner støtte og råd fra Dr. Jill Hutchcroft, direktør for Flow Cytometry Core Facility ved Purdue University. Dette arbeidet ble støttet av R01CA226259 og R01CA205420 til ALK, en American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 til ALK, en Purdue Shared ressursfasilitet tilskudd P30CA023168, og et flaggskip Fulbright doktorgradsstipend tildelt av Department of the State, USA til HH
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
