Analyse af dannelse af proteinkompleks ved mikromolære koncentrationer ved at koble mikrofluidik med massefotometri

Summary

Denne protokol kombinerer massefotometri med et nyt mikrofluidiksystem til at undersøge protein-protein-interaktioner med lav affinitet. Denne tilgang er baseret på hurtig fortynding af stærkt koncentrerede komplekser i opløsning, hvilket muliggør målinger med lav affinitet og udvider anvendeligheden af massefotometri.

Abstract

Massefotometri er en alsidig massemålingsteknologi, der muliggør undersøgelse af biomolekylære interaktioner og kompleks dannelse i opløsning uden etiketter. Massefotometri er generelt velegnet til analyse af prøver i koncentrationsområdet 100 pM-100 nM. I mange biologiske systemer er det imidlertid nødvendigt at måle mere koncentrerede prøver for at studere lavaffinitet eller forbigående interaktioner. Her demonstrerer vi en metode, der effektivt udvider området for prøvekoncentrationer, der kan analyseres ved massefotometri fra nanomolær til snesevis af mikromolarer.

I denne protokol kombineres massefotometri med et nyt mikrofluidiksystem for at undersøge dannelsen af proteinkomplekser i opløsning i det mikromolære koncentrationsområde. Med mikrofluidiksystemet kan brugerne opretholde en prøve ved en ønsket højere koncentration efterfulgt af fortynding til nanomolært område – flere millisekunder før massefotometrimålingen. På grund af fortyndingens hastighed opnås data, før prøvens ligevægt er skiftet (dvs. dissociation af komplekset).

Teknikken anvendes til at måle interaktioner mellem et immunoglobulin G (IgG) antistof og den neonatale Fc-receptor, hvilket viser dannelsen af højordens komplekser, der ikke var kvantificerbare med statiske massefotometrimålinger.

Afslutningsvis gør kombinationen af massefotometri og mikrofluidik det muligt at karakterisere prøver i det mikromolære koncentrationsområde og er dygtig til at måle biomolekylære interaktioner med svagere affiniteter. Disse evner kan anvendes i en række sammenhænge – herunder udvikling og design af bioterapi – hvilket muliggør grundig karakterisering af forskellige protein-protein-interaktioner.

Introduction

Protein-protein-interaktioner understreger de fleste cellulære funktioner, fra immunregulering til DNA-replikation og translation. Som følge heraf er der et grundlæggende behov i hele biovidenskaben for at undersøge en lang række interaktioner på tværs af forskellige heterogene komplekser, der almindeligvis dannes. Imidlertid er deres påvisning, karakterisering og kvantificering ofte udfordrende, især for interaktioner med lav affinitet¹.

Immunofældningsanalyser bruges ofte til at detektere interaktioner med høj affinitet, men for interaktioner med lav affinitet og forbigående interaktioner er detektion stort set umulig². Fluorescensteknikker kan også anvendes, men kræver potentielt forstyrrende tilføjelse af fluorescerende etiketter². Cryo-EM kan give et strukturelt øjebliksbillede og en ensembleaflæsning af proteinkomplekserne dannet med høj rumlig opløsning, men kræver også typisk arbejde ved koncentrationer, der er for lave til billeddannelse af lavaffinitetsinteraktioner. Cryo-EM medfører også udfordringer relateret til omkostninger, tilgængelighed, prøveforberedelse og analysetid³.

Derudover er overfladeplasmonresonans (SPR) blevet en populær måde at kvantificere protein-proteininteraktioner på, selvom det kræver proteinimmobilisering, hvilket kan påvirke bindingsligevægten og resultere i variable on-rates, hvilket reducerer målenøjagtigheden ^4,5. Det involverer også flere analysetrin forud for dataindsamling og analyse⁶.

Massefotometri er en enkeltmolekyleteknik, der er blevet brugt til at analysere protein-proteininteraktioner ^5,6,7. Det virker ved at måle massen af enkelte molekyler eller komplekser baseret på det lys, de spreder, når de lander på overfladen af et glasdæksel⁸. Massefotometrimålinger er blevet brugt til at kvantificere bindingsaffiniteter fra den relative overflod af bindingspartnere og de komplekser, de danner⁵. Ikke desto mindre bør koncentrationen af prøven, der skal måles, ligesom andre enkeltmolekyleteknikker typisk være mindre end 100 nM. Hvis koncentrationen er højere, vil molekylerne, der lander på glasoverfladen, overlappe rumligt, hvilket resulterer i dårlig datakvalitet⁷. Derfor kan svagere interaktioner (K_D ~ mikromolarer), som dissocierer ved disse lavere koncentrationer, ikke måles pålideligt, da det ikke er muligt at observere den nødvendige blanding af ubundne og bundne arter⁵.

Her beskriver vi en tilgang, der overvinder denne begrænsning baseret på en ny koblet mikrofluidik massefotometrienhed. Specifikt anvendes et mikrofluidiksystem i kombination med massefotometeret til effektivt at udvide rækkevidden af interaktioner, der kan kvantificeres ved massefotometri. Mikrofluidik har vist sig at tilbyde en række muligheder for at undersøge protein-protein-interaktioner, herunder hurtig fortynding for at detektere svage interaktioner ^1,9. Systemet beskrevet heri fungerer ved hurtigt at fortynde prøven op til 10.000 gange på en mikrofluidisk chip og straks strømme den over chippens observationsområde, hvilket gør det muligt for massefotometrimålingen at starte inden for 50 ms fra det tidspunkt, hvor molekylerne begyndte fortyndingsprocessen¹⁰. Fortyndingen sker, når prøven og bufferen kombineres i en omvendt Tesla-ventilblander på chippen, hvor de relative strømningshastigheder for de to opløsninger bestemmer mængden af fortynding, der forekommer (se protokoltrin 8). Strømningshastigheden kan styres med den mikrofluidiske styringssoftware. Ændring af strømningshastigheden kan ændre artens relative population, da det kan påvirke antallet af landingshændelser på overfladen af glasset, hvilket er det, der måles med massefotometeret.

Processens hastighed er hurtig nok til, at målingen kan afsluttes, før interaktionens integritet er blevet forstyrret (for yderligere detaljer, se også diskussionen). Dette kan forstås gennem et kort kig på teorien om førsteordensreaktioner, hvor . Den fremadrettede (association) hastighedskonstant er k_f, den bagudrettede (dissociation) hastighedskonstant er k_b, og ligevægtsdissociationskonstanten (K_D) er defineret som

K_D= k_b/ k_f

For proteinbinding er k_fgenerelt begrænset af reaktanternes diffusion¹¹ og er derfor begrænset til området 10^{6-10 7 M-1}·^s-1. Fordi rækkevidden af er begrænset, vil en lavaffinitetsreaktion (K_D ~ mikromolarer) have k_b≈ 1 ^s-1. Det vil sige k_b = k_f  · K_D = (10^{6 M-1}·^s-1) (^10-6 M) = 1 ^s-1, med kompleksets halveringstid omkring 0,7 s^11,12.

Vores eksempelsystem er bindingen af IgG monoklonalt antistof trastuzumab til det opløselige domæne af IgG neonatal Fc-receptoren (FcRn), som er kendte interagerende partnere¹³. Tidligere offentliggjorte data opnået ved hjælp af konventionel massefotometri alene (dvs. med manuel fortynding af prøver) viste, at proteinerne danner flere arter. FcRn-monomerer, FcRn-dimerer og ubundet IgG var tydeligt synlige, mens IgG-FcRn-komplekser (i forholdet 1:1 og 1:2) også blev påvist (ved pH 5,0), men kun med meget lav forekomst⁵. Denne observation rejser spørgsmålet om, hvorvidt IgG-FcRn-kompleksdannelse kunne detekteres tydeligere, hvis den måles ved en højere koncentration. Faktisk gav kombinationen af massefotometri med en koblet hurtig fortyndingsmetode, der er beskrevet her, mere robust bevis for kompleks dannelse ved en stigning i deres målte partikler.

Massefotometri- og mikrofluidikprotokollen beskrevet her gør det muligt at karakterisere dannelsen af komplekser med en K_D op til mikromolært område. En empirisk bestemmelse af K_D vil kræve yderligere forbedringer af flowsensorens nøjagtighed, pumpestabilitet, chip-til-chip-variationer og måleplacering inde i observationsvinduet, da alle disse faktorer vil påvirke tiden fra prøven fortyndes til måles.

Den samme fremgangsmåde kan anvendes til at undersøge binding mellem opløselige proteiner, forudsat at de har forskellige molekylvægte (adskilt af mindst 25 kDa), der ligger inden for det område, der er egnet til analyse med et massefotometer (30 kDa til 6 MDa). De opnåede indsigter kan være nyttige til undersøgelser i en række sammenhænge – fra at få en mekanistisk forståelse af cellulære funktioner til design af nye bioterapeutiske lægemidler.

Protocol

1. Forberedelse af instrumenterne og lancering af softwaren Tænd for massefotometeret, og lad det være tændt i mindst 1 time, før du starter målinger.BEMÆRK: Dette skyldes, at instrumentet skal nå en konstant temperatur. Hvis massefotometeret ikke er tændt i 1 time, kan det føre til et masseskift og derfor unøjagtige resultater. Tænd for antivibrationsbordet ved at tænde for strømmen og trykke på isolationsknappen (under massefotometeret). Vibrationer begrænser massefotometriinstrumentets ydeevne, så antivibrationstabellen er vigtig for at sikre maksimal instrumentfølsomhed. Tænd for mikrofluidikboksen. Start dataindsamlingssoftwaren og mikrofluidikstyringssoftwaren. Tænd for luftkompressoren. 2. Forberedelse af proteinprøver, buffer og rengøringsopløsninger Tilsæt 200 ml PBS (pH 7,4) buffer til en ren 200 ml flaske og 200 ml PBS (pH 5,0) buffer til en anden 200 ml flaske.BEMÆRK: 200 ml flaskerne skal tilsluttes “L” flowenhedssensoren i de næste trin. Brug pH 7,4 PBS-buffer til kalibreringsmåling og pH 5,0 PBS-buffer til prøvemåling. I et 0,5 ml centrifugeglas blandes IgG (2 μM) og FcRn (20 μM) i forholdet 1:10 for et samlet volumen på 60 μL.Lagerløsningerne til FcRn og IgG er henholdsvis 91,9 μM og 13,5 μM. Reaktionen fremstilles ved at blande 9 μL stam IgG + 13 μL stam FcRn + 38 μL PBS (pH 5,0, stuetemperatur [RT]) i et centrifugeglas til et samlet volumen på 60 μL. De endelige koncentrationer for de to reaktanter var 2 μM for IgG og 20 μM for FcRn. Hold alle proteinlagre på is under hele denne proces. I et andet 0,5 ml centrifugeglas dispenseres 20 μL af β-Amylase-kalibranten ved 20 μM koncentration.For eksempel skal du følge proceduren i punkt 2.3.1.1-2.3.1.2 for at forberede den β-Amylase-kalibrant, der anvendes her.Resuspender 20 mg β-Amylase-pulver i hætteglasset i 3,57 ml PBS (5% glycerol), svarende til 5,6 mg/ml og en molær koncentration på 100 μM (da molekylvægten er 56 kDa). For at fortynde til 20 μM kombineres 200 μL af 100 μM stammen med 800 μL PBS (pH 7,4, RT) i et 1 ml centrifugeglas. Inkuber prøverne ved RT i mindst 30 minutter.BEMÆRK: Begynd at forberede prøven og kalibreringsfortyndingerne, når massefotometeret er tændt. Til dette forsøg blev prøverne inkuberet i 120 minutter. I tre 50 ml centrifugeglas alikvote: 50 ml PBS (pH 7,4) – rengøringsopløsning 1 (CS1), 50 ml 0,5 M NaOH – rengøringsopløsning 2 (CS2) og 50 ml 100% IPA – rengøringsopløsning 3 (CS3). 3. Forsøgsopstilling For at fylde prøven og kalibranten anbringes kalibreringscentrifugerøret i position 4 og prøvecentrifugeglasset i position 5 i mikrofluidikboksen (figur 1). For at indlæse rengøringsopløsningerne skal du placere CS1, CS2 og CS3 i position 1, 2 og 3 i mikrofluidikboksen (figur 1).BEMÆRK: Prøve-, kalibrerings- og rengøringsopløsningerne er forbundet til multikontakten (m-switch). M-kontakten er tilsluttet flowenhedssensoren “S”. Skru hætten, der forbinder til bufferledningen, på bufferflasken på 200 ml (pH 7,4).BEMÆRK: Bufferledningen er forbundet til en afspærringsventil, som er forbundet til “L” flowenhedssensoren. Afspærringsventilen forhindrer eventuelle sifoneringseffekter, der kan opstå, når bufferstrømmen stoppes. Sifonering kan føre til kontaminering af bufferen fra den fortyndede restvæske, der vender tilbage til bufferbeholderen. Placer mikrofluidikchippen på en forberedelsesplade.Skub den anden rørende af “S” flowenhedssensoren ind i “Prøveindtag” på den første kanal i mikrofluidikchippen (figur 1). Prøvelinjen er fuldført. Skub den anden rørende af “L” flowenhedssensoren ind i “Bufferindtaget” i den første kanal i mikrofluidikchippen (figur 1). Bufferlinjen er komplet. For at opsamle udstrømningen skal du skubbe et rør til “Outlet” af den første kanal i mikrofluidikchippen; Den anden ende placeres, så den løber ud i en affaldsmodtagelig kolbe eller et bægerglas (figur 1). 4. Priming af prøve- og bufferledningerne med buffer Åbn den manuelle afspærringsventil på bufferledningen. I mikrofluidikstyringssoftwaren skal du indstille bufferlinjens strømningshastighed til 1000 μL/min og sikre, at bufferledningstrykket ikke overstiger 110 mbar (figur 2). Flowet starter automatisk i bufferlinjen (figur 1).BEMÆRK: Hvis bufferledningstrykket overstiger 110 mbar, kan det skyldes, at luft passerer gennem flowsensoren. Hvis trykket ikke går tilbage til det normale inden for få sekunder, er der potentielt en blokering (normalt på grund af klemt slange ved forbindelserne). I så fald skal du stoppe flowet og kontrollere forbindelserne i bufferledningen, startende ved afspærringsventilen. I mikrofluidikstyringssoftwaren skal du vælge position 1 på m-kontakten (svarende til PBS-bufferen) og derefter indstille prøvelinjestrømningshastigheden til 8 μL/min og sikre, at prøveledningstrykket ikke overstiger 350 mbar. Flowet starter automatisk i prøvelinjen (figur 1). Brug en pipettespids (eller anden blød plastkomponent) til at lægge et let tryk ovenfra nær boblen (boblerne), der er fanget i chippen, for at løsne luftbobler og sikre, at de fjernes gennem udløbet.BEMÆRK: Sørg for at fjerne alle bobler i sektionerne ‘mixer’ og ‘observationsområde’ (figur 1) i den anvendte kanal. Pas på ikke at skubbe for hårdt, da dette kan beskadige chippen. 5. Placering af mikrofluidikchippen på massefotometeret og find fokus Påfør en dråbe mikroskopnedsænkningsolie på målet med massefotometeret. Placer mikrofluidikchippen på holderen af massefotometeret med “prøveindtaget” opad, og hold den fastgjort til sceneklemmerne (figur 1). Sørg for, at alle slangetilslutninger forbliver tilsluttet. Brug dataindsamlingssoftwaren til at flytte scenen for at sikre, at “observationsområdet” på kanal 1 er tilpasset målet (figur 1). Luk massefotometerlåget, og tryk på indstillingen Dråbefortyndingsfokus i dataindsamlingssoftwaren. Kontroller den hvide fokusring i nederste venstre hjørne af dataindsamlingssoftwaren (figur 3). Huller i ringen indikerer tilstedeværelsen af en luftboble i nedsænkningsolien; Fjern dette ved at øge trinhastigheden til det maksimale og forsigtigt bevæge scenen sideværts. Når fokuseringen er afsluttet, skal du vente 2-3 minutter, før du tager den første optagelse. Tryk derefter på Optag for at registrere en måling på 1 minut og sikre (ved at observere målingen), at der ikke forekommer urenheder.BEMÆRK: Urenheder kan være på glasoverfladen eller i bufferen. Skarphedsværdien i dataindsamlingssoftwaren skal være over 4.5%. 6. Kalibrering af massefotometri I mikrofluidikstyringssoftwaren skal du skifte m-kontakten til position 4 (svarende til kalibreringen) og sikre, at prøveledningsstrømningshastigheden er indstillet til 8 μL/min, og at prøveledningstrykket ikke overstiger 350 mbar (figur 2).Kalibranten begynder strømmen gennem chippen. Vent ca. 1,5-2,5 min (eller indtil kalibreringen ses konsekvent på dataindsamlingssoftwaren). Tiden kan variere afhængigt af prøvelinjens slangelængde. Når kalibreringen er set konsekvent (dvs. antallet af hændelser er tilstrækkeligt til en nøjagtig massefotometrimåling), reduceres strømningshastigheden i mikrofluidikstyringssoftwaren til 0,5 μL / min – målfortyndingsniveauet for dette eksperiment.BEMÆRK: Begyndende med en højere strømningshastighed reducerer simpelthen den tid, det tager for kalibranten at nå chippen. Sørg for, at der ikke lander “for få” eller “for mange” molekyler på målefladen (figur 4).Hvis landingshændelsens tæthed ikke er “ideel” (figur 4), skal du ændre strømningshastigheden i mikrofluidikstyringssoftwaren. Hvis hændelsestætheden er for lav, øges prøvestrømningshastigheden, indtil der observeres godt adskilte landingshændelser (men må ikke overstige 8 μL/min). Hvis den er for høj, skal du reducere prøvestrømningshastigheden (men gå ikke under 0,1 μL / min). Hvis kalibreringsvolumenet er ved at løbe tør i prøveglasset, skal du ændre m-switch-positionen til PBS pH 7,4-linjen (position 1) for at undgå indsprøjtning af luft. Tryk på Optag og tag en 60 s måling. Gem filen i en valgt mappe.BEMÆRK: Dataindsamlingssoftwaren producerer filer med .mp som udvidelse. 7. Rengøring af prøveledningen og stop af flowet I mikrofluidikstyringssoftwaren skal du skifte til position 2 på m-kontakten og ændre prøvetrykket til 800 mbar (figur 2). Skyl systemet med CS2 (NaOH) i 4 min. Skift til position 3 på m-switchen, og skyl systemet med CS3 (IPA) i 4 min. Skift til position 1 på m-kontakten, og skyl systemet med CS1 (PBS) i 4 min. I mikrofluidikstyringssoftwaren skal du stoppe alt flow ved at indstille prøveledningen og bufferledningstrykket til 0 og lukke bufferventilen. Afbryd chippen fra scenen, og læg den tilbage på klargøringspladen. Afbryd alle slanger, og læg prøveslangenden i en affaldsflaske. Rengør målet med isopropanol og klude. 8. Måling af massefotometriprøven Skru hætten, der er tilsluttet bufferflasken på 200 ml (pH 7,4), af, og skru den fast på bufferflasken med 200 ml (pH 5,0). Gentag trin 3.4-5.6, men brug den anden kanal i chippen i stedet for den første. I mikrofluidikstyringssoftwaren skal du skifte m-kontakten til position 5 (svarende til prøven), indstille prøvelinjens strømningshastighed til 8 μL/min og sikre, at prøveledningstrykket ikke overstiger 350 mbar (figur 2). Gentag trin 6.2-6.4 for at måle prøven.For at beregne de strømningshastigheder, der skal bruges, skal du sikre dig, at foldforskellen i strømningshastighed svarer til den ønskede prøvefortyndingsfaktor. For eksempel for at opnå fortyndingen af 2000x her adskiller strømningshastighederne sig med en faktor på 2000; bufferstrømningshastigheden er 1000 μL / min, og prøvestrømningshastigheden er 0,5 μL / min. Ved afslutningen af et eksperiment skal du altid lade linjerne være rene ved at følge rengøringsprotokollen. 9. Analyse af data Når indsamlingen af data er afsluttet, skal du starte dataanalysesoftwaren (figur 5). Klik på plusikonet (+) øverst til venstre, og vælg .mp-kalibreringsfilen. Softwaren begynder at analysere den indlæste fil. Afhængigt af størrelsen og antallet af målinger kan dette tage et par minutterAnalysér ikke .mp-filer i dataanalysesoftwaren, mens du henter data med dataindsamlingssoftware, da dette kan reducere kvaliteten af de data, der hentes. Tryk på knappen Opret massekalibrering (nederst til højre). Der åbnes en dialogboks, der viser en tabel befolket med kontrastværdierne for de tilpassede toppe. Skift værdierne til de kendte masseværdier for de tilpassede toppe (for β-amylase er disse værdier 56 kDa, 112 kDa og 224 kDa), og tryk på Gem. Den nyoprettede kalibreringsfil (filtypenavnet .mc) vises i panelet Massekalibrering (nederst til venstre i dataanalysesoftwaren) (figur 6). Klik på plusikonet (+) øverst til venstre, og vælg .mp-eksempelfilen. For at oprette et massehistogram, som vist i figur 5, skal du gå til fanen Analyse , vælge histogramtilstand og indstillingen Masseplot . Juster beholderbredden, massegrænserne og andre parametre efter behov. Tilpas afbildningen yderligere under fanen Figurer , hvis det ønskes, før du eksporterer figurer og/eller gemmer hele arbejdsområdet som en .dmp fil.

Representative Results

Massefotometri blev anvendt til at måle interaktionen mellem IgG monoklonalt antistof trastuzumab og det opløselige domæne af IgG neonatal Fc receptor (FcRn). En 1:10 blanding af de to proteiner (ved 2 μM for IgG og 20 μM for FcRn) blev fortyndet manuelt til henholdsvis 10 nM og 20 nM i PBS. Fortyndingstrinnet er nødvendigt, fordi massefotometri, en enkeltmolekyle massemålingsteknik, kun kan analysere prøver i området 100 pM-100 nM. Forsøg på at måle prøver med koncentrationer uden for dette interval kan bringe resultaternes nøjagtighed i fare (figur 4). Dette eksperiment er ikke omfattet af denne protokol, da det tidligere er beskrevet 5,6. I massehistogrammerne, der produceres i et massefotometrieksperiment, afbildes styrken af spredningssignalet (eller ‘kontrasten’) for hver landingsbegivenhed på x-aksen, og det konverteres til molekylmasse via massekontrastkalibreringstrinnet. I mellemtiden angiver y-aksen antallet af molekyler talt med en given masse (eller kontrast). Derfor indikerer en top tilstedeværelsen af en population af molekyler inden for molekylvægtområdet vist på x-aksen. Antallet af begivenheder (tællinger), der udgør toppen, afspejler størrelsen af denne befolkning. Massefotometrimålingen med manuel fortynding resulterede i et massehistogram, hvor de to største toppe, baseret på proteinernes forventede molekylvægt, svarede til ubundne FcRn-monomerer (~50 kDa) og IgG-antistofmonomerer (~150 kDa) (figur 7). I lighed med de tidligere offentliggjorte massefotometridata5 var de ubundne arter fremtrædende, mens toppe i masseområderne, der ville svare til komplekser, var meget mindre tydelige. Forsøget blev gentaget ved hjælp af et mikrofluidiksystem med hurtig fortynding for at fortynde blandingen til den nødvendige koncentration umiddelbart før massefotometrimålingen. Denne fremgangsmåde muliggjorde påvisning af yderligere komplekser med lav affinitet, som kan have dissocieret under det manuelle fortyndingstrin. For at opnå den samme 2000x fortyndingsfaktor, der blev anvendt under det manuelle fortyndingsforsøg, blev prøveblandingen 1:10 (ved 2 μM koncentration for IgG og 20 μM for FcRn) strømmet til den mikrofluidiske chip med en hastighed på 0,5 μL/min sammen med PBS-buffer (pH 5,0) ved en strømningshastighed på 1 ml/min. For at sikre, at proteinerne ikke blev nedbrudt på måletidspunktet, blev IgG (2 μM) og FcRn (20 μM) målt under flow med mikrofluidiksystemet efter 120 minutters inkubation af prøverne. Individuelle kontrolmålinger viste ingen proteinnedbrydning (supplerende figur 1) For prøven, der gennemgik hurtig fortynding, kunne toppene svarende til FcRn-monomerer (53 kDa), FcRn-dimerer (97 kDa) og IgG-monomerer (148 kDa) igen observeres. To yderligere toppe blev også tydeligt observeret ved 196 kDa og 251 kDa, svarende til IgG-FcRn-komplekser med 1:1 og 1:2 støkiometrier (figur 7). De forventede masser for disse to komplekser var henholdsvis 200 kDa og 250 kDa. Variabiliteten i massemålingen ligger inden for målefejlen for massefotometeret, der anvendes i denne undersøgelse, er ±5 (2% for 1:1-komplekset og 0,4% for 1:2-komplekset). Tilstedeværelsen af disse komplekser i kun den hurtigt fortyndede prøve er i overensstemmelse med ideen om, at de har tendens til at dissociere ved lavere koncentrationer med en hastighed, der er hurtig i forhold til en manuel fortyndingsproces, men langsom i forhold til processen med hurtig fortynding opnået med mikrofluidiksystemet15. Figur 1: Kombination af mikrofluidik med massefotometri. (A,B) Den mikrofluidikboks, der anvendes i denne protokol, set fra (A) forsiden og (B) toppen. Rengøringsopløsningerne placeres i position 1-3, og prøverne og kalibranterne i position 4-6. Alle løsninger er forbundet til m-switchen, som er forbundet til den “lille” flowenhedssensor. (C) Oversigt over hele systemet. Computeren (øverst til venstre) er forbundet til mikrofluidikboksen (vist ved siden af bufferen og prøverørene) og massefotometeret (nederst til højre), hvor mikrofluidikchippen er placeret. Den lille flowhastighedsmonitor (FRMS) overvåger flow gennem prøvelinjen, mens den store flowhastighedsmonitor (FRML) overvåger bufferflow. Prøven og bufferledningsslangen forbindes til en kanal på mikrofluidikchippen, der er placeret inde i massefotometeret. (D) Hver chip har tre kanaler. FRMS er forbundet til prøveindløbet og FRML til bufferindløbet. Blandeområdet er, hvor hurtig prøvefortynding finder sted, mens observationsområdet er, hvor massefotometrimålingerne udføres. Udløbet overvåges af en ekstra flowsensor for at sikre, at der ikke er lækager i chippen. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Mikrofluidikstyringssoftwaren. Med denne software skal du indstille og overvåge strømningshastighederne, trykledningerne i mikrofluidiksystemet og placeringen af multikontakten (m-switch). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Identifikation af tilstedeværelsen af bobler i olien. Eksemplerne fra dataindsamlingssoftwaren viser en klar, ubrudt fokusring (venstre) og en ‘brudt’ ring, der indikerer tilstedeværelsen af luftbobler i nedsænkningsolien (højre). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Repræsentative eksempler på prøvekoncentrationer, hvor antallet af molekylelandingshændelser er for få, ideelle eller for mange. Molekyler, der lander på overfladen af observationsområdet i mikrofluidikchippen, vises som mørke pletter i den ratiometriske visning af massefotometribilledet. Optimalt set bør den ønskede koncentration gøre det muligt at finde en ideel tæthed af landingshændelser sted under dataindsamling (midten). Hvis landingshændelsens tæthed er for lav (øverst, ‘For få’), kan nøjagtig statistisk analyse af massefotometridataene ikke gennemføres. Hvis det er for højt (nederst, ‘For mange’), vil landingsmolekylerne overlappe rumligt, hvilket vil resultere i dårlig datakvalitet. Disse billeder blev taget med dataindsamlingssoftwaren ved hjælp af et massefotometer. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 5: Et skærmbillede af dataanalysesoftwaren til massefotometri. Her kan de .mp-filer, der eksporteres fra dataindsamlingssoftwaren, indlæses for at analysere dataene. Tal kan genereres ud fra de behandlede data. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 6: Et skærmbillede af massekontrastkalibreringen for dette eksperiment. Den anvendte kalibrant var β-Amylase, som vides at danne tre arter: monomer (56 kDa), dimer (112 kDa) og tetramer (224 kDa). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 7: Massehistogrammer afslører først kompleks dannelse efter hurtig prøvefortynding. Massehistogrammer og tilsvarende bedst egnede gaussiske fordelinger vises til måling af prøver indeholdende IgG og FcRn efter manuel fortynding (orange) eller hurtig fortynding via microfluidicsHC-systemet (blå). Masseetiketterne angiver, at middelværdierne fra de gaussiske kurver passer til massehistogrammerne målt efter hurtig fortynding. Efter manuel fortynding blev der observeret toppe svarende til FcRn-monomerer (52 kDa, målt med manuel fortynding) og IgG-monomerer (152 kDa). Efter hurtig fortynding blev der ud over FcRn- og IgG-monomererne også observeret toppe svarende til FcRn-dimerer og IgG-FcRn-komplekser med 1: 1 og 1: 2 støkiometri. Klik her for at se en større version af denne figur. Supplerende data Figur 1: Massefotometrimålinger af kontrolprøver efter hurtig fortynding viser ingen proteinnedbrydning. A) Massehistogram og bedst egnet gaussisk fordeling for prøven, der kun er FCRN. Den oprindelige prøvekoncentration før hurtig fortynding var 20 μM, og strømningshastigheden blev indstillet til 0,5 μL/min. Massetoppe svarende til FcRn-monomerer (53 kDa) og FcRn-dimerer (97 kDa) kunne observeres. (B) Massehistogram og bedst egnet gaussisk fordeling for prøven, der kun består af IgG (Herceptin). Den oprindelige prøvekoncentration før hurtig fortynding var 2 μM, og strømningshastigheden blev indstillet til 1 μL/min. En enkelt massetop svarende til IgG-monomer (155 kDa) kunne observeres. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den her skitserede protokol giver en metode til påvisning og kvantificering af protein-protein-interaktioner med lav affinitet. Det bruger et massefotometer koblet til et mikrofluidiksystem med hurtig fortynding. Massefotometri er et etiketfrit, bioanalytisk værktøj, der pålideligt kan måle molekylmasse i opløsning til biomolekyler¹⁶ for dem inden for området 30 kDa til 6 MDa. Da massefotometri er en enkeltmolekyleteknik, der analyserer prøver en efter en, er den generelt begrænset til prøver i koncentrationsområdet 100 pM-100 nM. Over dette område vil molekylerne, der lander på glasoverfladen, overlappe rumligt, hvilket resulterer i dårlig datakvalitet; Under dette interval opnås for få data til at foretage robust analyse⁷. En vigtig konsekvens er, at det kan begrænse undersøgelsen af proteininteraktioner til dem, der danner en blanding af bundne og ubundne arter inden for dette interval.

Her detaljerede vi en trinvis protokol til brug af et mikrofluidiksystem med hurtig fortynding til effektivt at udvide området for prøvekoncentrationer, der er modtagelige for massefotometri. Ved at fortynde prøven på den mikrofluidiske chip og derefter strømme den over detektorobservationsvinduet inden for 50 ms fanger systemet de komplekser, der er til stede i den ufortyndede prøve, før interaktionsligevægten skifter. Prøven leveres løbende til detektoren under individuelle målinger. Under disse betingelser forbliver 95% af komplekset intakt, når prøven måles, selv for interaktioner med lav affinitet – med en K_D i størrelsesordenen mikromolarer og dissociationshastigheder så hurtigt som 1 ^s-1.

Dette kan beregnes som følger: For en reaktion med en fremadrettet sats k_fog bagudrettet hastighed k_b,

Ved ligevægt forbliver koncentrationerne af alle tre arter (A, B og komplekset AB) konstante, så og . Under den konservative antagelse, at forstyrrelsen (fortynding, i dette tilfælde) kan få komplekset til at dissociere, men den fremadrettede (association) reaktion ikke fortsætter, kan udtrykket k_f [A] [B] behandles som ubetydelig, og følgende forenkling kan foretages:

Integration giver følgende udtryk for koncentrationen af kompleks på tidspunktet efter forstyrrelsen af ligevægt:

Den brøkdel af komplekset, der forbliver bundet på tidspunktet t efter forstyrrelsen af ligevægt, er således:

Ved = 50 ms, for en reaktion med k_b≈ 1 ^s-1, er brøkdelen bundet 0,95 eller 95%^11,12.

Massefotometri blev brugt her og tidligere⁵ til at undersøge bindingen af IgG monoklonalt antistof trastuzumab til det opløselige domæne af FcRn. De to bindingspartnere er rapporteret at binde med nanomolær affinitet ved sur pH¹⁷. Massefotometri blev anvendt til kvalitativt at vurdere forekomsten af de dannede komplekser, mens bindingspartnerne var ved pH 5,0, og prøverne blev hurtigt fortyndet gennem et yderligere mikrofluidisk system. Proceduren blev optimeret til den særlige protein-protein-interaktion baseret på tidligere rapporterede resultater⁵. Den samme procedure kan bruges til at studere andre interaktioner, forudsat at brugerne har forudgående viden eller optimerer de eksperimentelle betingelser for det pågældende system, såsom hvilke buffere der skal bruges, den indledende proteinkoncentration, den forventede støkiometri og mængden af inkubation, der er nødvendig for at tillade interaktionen at nå en ligevægt.

Når IgG-FcRn-blandingen blev fortyndet manuelt, var det vanskeligt at detektere tilstedeværelsen af IgG-FcRn-komplekser, selvom disse proteiner vides at interagere⁵. Dette papir viser, at den hurtige fortyndingsmetode resulterer i en markant øget mængde af disse komplekser. For den samme prøve, når hurtig fortynding blev anvendt, blev 1: 1 FcRn-IgG-komplekser og 2: 1 FcRn-IgG-komplekser begge tydeligt observeret. Disse forskelle i kompleks dannelse demonstrerer vigtigheden af at studere biomolekylære interaktionssystemer på tværs af en bred vifte af koncentrationer.

Derudover viser disse resultater også, at det er ligetil at bruge mikrofluidik med enkeltmolekyleanalyse til at fange svage interaktioner – udfylde et betydeligt hul i metoden. Kombinationen af hurtigfortyndingsmikrofluidik med massefotometri giver attraktive fordele på grund af fordelene ved massefotometri som analytisk teknik. Det vil sige, massefotometri kræver ikke etiketter, involverer minimal prøveforberedelse, og målingerne udføres i opløsning. For denne protokol er en anden vigtig fordel ved massefotometri dens evne til at skelne og kvantificere alle de dannede arter (forudsat at de har en særskilt masse på >30 kDa). Dette er i modsætning til SPR, for eksempel, som kan måle bindings- og ikke-bindingshastigheder, men ikke let kan give støkiometrioplysninger⁸.

For denne protokol såvel som massefotometrieksperimenter mere generelt er flere overvejelser nyttige. For det første skal den endelige proteinkoncentration være inden for grænsen for, hvad massefotometri kan måle (100 pM-100 nM). Startinkubationskoncentrationen bør også ligge inden for det mikrofluidiske systems område (op til 90 μM) og teoretiseres til at være over den faktiske K_D af interaktionen¹⁰. Det anbefalede udgangspunkt er et koncentrationsblandingsforhold på 1:1 mellem de interagerende arter ved μM-koncentration. Forholdet kan derefter varieres til 1:2, 1:5 eller, som i tilfældet med denne interaktion, 1:10. Hvis der ikke er nogen tidligere oplysninger om proteininteraktionerne, skal brugeren optimere eksperimentet, begyndende med en høj koncentration (anbefalet 20 μM) for hver partner for at afgøre, om komponenternes affinitet er inden for det koncentrationsområde, der opretholdes ved den præsenterede metode (dvs. komplekser dannes). Optimering kan også omfatte valg af andre bufferbetingelser for at fremme interaktionerne eller titreringen af en af interaktionskomponenterne for at bestemme det rigtige blandingsforhold. Når disse er bestemt, er det muligt at optimere koncentrationer og strømninger, så der er optimale betingelser for undersøgelsen og metoden, f.eks. ved at sænke koncentrationerne for at muliggøre bedre topopløsning.

For det andet bør urenheder minimeres for at kunne replikere dette eksperiment. Almindelige kilder til urenheder, der vides at påvirke massefotometrimålinger negativt, omfatter andre proteiner eller cellulært affald, der forbliver efter rensning, ufiltrerede buffere, micelledannende rengøringsmidler (hvis de er til stede i for høj koncentration) og buffere indeholdende høje koncentrationer af salt, glycerol eller andre komponenter. Som diskuteret i protokollen ovenfor bør bobler i mikrofluidiksystemet fjernes. Der kan dannes bobler i slangesystemet, eller hvis prøverne har høj overfladespænding og er tilbøjelige til skumdannelse. Der kan også dannes bobler i nedsænkningsolien, som kan detekteres fra fokusringen (figur 3). Hvis bobler ikke kan fjernes ved hjælp af de trin, der er beskrevet i protokollen, er en anden løsning at afgasse prøven ved hjælp af en ekssikkator og en vakuumpumpe, så prøven efterlades under reduceret tryk i et par minutter. Vortexing eller rystning af stærkt koncentrerede proteinopløsninger anbefales ikke, da disse handlinger kan fremme bobledannelse.

Mens målingen af en specifik protein-protein-interaktion demonstreres her, kan den samme protokol anvendes på andre protein-protein-interaktionssystemer uden væsentlig ændring. En yderligere fremtidig retning for denne protokol ville være at bruge målingerne til at beregne K_D-værdier for de identificerede komplekser, som det er beskrevet andetsteds i forbindelse med massefotometri ^5,7. Mens de tidligere undersøgelser anvendte data fra eksperimenter, der involverede manuel fortynding og stærkere interaktioner, kunne analyseprincippet let anvendes i denne sammenhæng – forudsat at der implementeres yderligere forbedringer i den mikrofluidiske enhed (såsom øget flowsensornøjagtighed og pumpestabilitet).

Ud over protein-protein-interaktioner vil der sandsynligvis være bredere anvendelser for den kombinerede massefotometri og hurtigfortyndingsmikrofluidik-tilgang. Massefotometri kan bruges til at vurdere prøvens renhed, aggregering og homogenitet^18,19; undersøgelse af proteinoligomerisering²⁰, makromolekylær samling²¹ eller polymerisering²²; og på andre områder. Massefotometrianalyse strækker sig også ud over proteiner; Det er blevet brugt til at undersøge interaktioner mellem nukleinsyrer og proteiner²³, virale partikler²⁴ og nanopartikler²⁵. Denne protokol beskriver således en vigtig anvendelse af et kombineret massefotometrimikrofluidiksystem – det muliggør direkte måling af svage protein-proteininteraktioner på niveau med individuelle molekyler og komplekser. Værdien af denne anvendelse er høj, da den åbner mulighed for ligefrem at karakterisere interaktioner, der generelt har været vanskelige at studere – med relevans på tværs af kritiske terapeutiske områder. Denne kombinerede tilgang kunne også tjene som grundlag for en bredere vifte af undersøgelser af prøver med koncentrationer op til snesevis af mikromolarer.

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Data acquisition software	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Mass photometer	Refeyn	TwoMP
Microfluidics box	Refeyn	MassFluidix HC system
Microfluidics chip	Refeyn	MassFluidix HC chip
Microfluidics control software	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, from sweet potato	Sigma	A8781