Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

Summary

이 프로토콜은 질량 측광법과 새로운 미세유체역학 시스템을 결합하여 저친화성 단백질-단백질 상호 작용을 조사합니다. 이 접근법은 용액에서 고도로 농축된 복합체의 빠른 희석을 기반으로 하며, 이를 통해 저친화성 측정이 가능하고 질량 측광법의 적용 가능성이 넓어집니다.

Abstract

질량 측광법은 라벨 없이 용액에서 생체 분자 상호 작용 및 복잡한 형성을 연구할 수 있는 다목적 질량 측정 기술입니다. 질량 측광법은 일반적으로 100 pM-100 nM 농도 범위의 시료를 분석하는 데 적합합니다. 그러나 많은 생물학적 시스템에서는 친화성이 낮거나 일시적인 상호 작용을 연구하기 위해 더 농축된 샘플을 측정해야 합니다. 여기에서는 질량 측광법으로 분석할 수 있는 시료 농도의 범위를 나노몰에서 수십 마이크로몰로 효과적으로 확장하는 방법을 보여줍니다.

이 프로토콜에서 질량 측광법은 새로운 미세유체역학 시스템과 결합되어 마이크로몰 농도 범위의 용액에서 단백질 복합체의 형성을 조사합니다. 미세유체역학 시스템을 통해 사용자는 시료를 원하는 더 높은 농도로 유지한 후 질량 측광 측정 몇 밀리초 전에 나노몰 범위로 희석할 수 있습니다. 희석 속도 때문에 샘플의 평형이 이동하기 전에(즉, 복합체의 해리) 데이터를 얻을 수 있습니다.

이 기술은 면역글로불린 G(IgG) 항체와 신생아 Fc 수용체 간의 상호 작용을 측정하는 데 적용되어 정적 질량 측광 측정으로 정량화할 수 없는 고차원 복합체의 형성을 보여줍니다.

결론적으로, 질량 측광법과 미세유체역학의 조합은 마이크로몰 농도 범위의 시료를 특성화할 수 있게 하며 친화도가 약한 생체 분자 상호 작용을 측정하는 데 능숙합니다. 이러한 기능은 바이오 치료제의 개발 및 설계를 포함한 다양한 상황에 적용될 수 있으며, 이를 통해 다양한 단백질-단백질 상호 작용의 철저한 특성 분석을 가능하게 합니다.

Introduction

단백질-단백질 상호 작용은 면역 조절에서 DNA 복제 및 번역에 이르기까지 대부분의 세포 기능을 강조합니다. 그 결과, 생명과학 전반에 걸쳐 일반적으로 형성되는 다양한 이질적인 복합체에 걸친 광범위한 상호 작용을 조사해야 할 근본적인 필요성이 있습니다. 그러나 이들의 검출, 특성화 및 정량화는 특히 저친화성 상호 작용의 경우 종종 까다롭습니다¹.

면역침전 분석은 친화도가 높은 상호작용을 검출하는 데 자주 사용되지만, 친화도가 낮고 일시적인 상호작용의 경우 검출이^{거의 불가능하다2}. 형광 기술도 사용할 수 있지만 형광 라벨을 추가해야 할 수 있습니다². Cryo-EM은 높은 공간 분해능으로 형성된 단백질 복합체의 구조적 스냅샷과 앙상블 판독을 제공할 수 있지만, 일반적으로 친화성이 낮은 상호 작용을 이미징하기에는 너무 낮은 농도에서 작업해야 합니다. 또한 Cryo-EM은 비용, 접근성, 시료 전처리 및 분석 시간과 관련된 문제를 야기합니다³.

또한 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 단백질-단백질 상호 작용을 정량화하는 데 널리 사용되는 방법이 되었지만, 단백질 고정화가 필요하므로 결합 평형에 영향을 미치고 가변 on-rate가 발생하여 측정 정확도가 떨어질 수 있습니다 ^4,5. 또한 데이터 수집 및 분석 전에 여러 분석 단계가 포함된다⁶.

질량 측광법은 단백질-단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용된 단일 분자 기술입니다 ^5,6,7. 이는 단일 분자 또는 복합체가 유리 커버슬립(glass coverslip)⁸의 표면에 닿을 때 산란되는 빛을 기반으로 질량을 측정함으로써 작동한다. 질량 측광 측정은 결합 파트너의 상대적 풍부도와 이들이 형성하는 복합체로부터 결합 친화도를 정량화하는 데 사용되어 왔다⁵. 그럼에도 불구하고, 다른 단일 분자 기술과 마찬가지로 측정할 샘플의 농도는 일반적으로 100nM 미만이어야 합니다. 농도가 높으면 유리 표면에 착륙하는 분자가 공간적으로 겹쳐져 데이터 품질이 저하됩니다⁷. 결과적으로, 이러한 낮은 농도에서 해리되는 더 약한 상호 작용_{(KD ~} 마이크로 몰)은 unbound 종과 bound 종의 필요한 혼합물을 관찰 할 수 없기 때문에 신뢰할 수 있게 측정 할 수 없습니다⁵.

여기에서는 새로운 결합 된 미세 유체 질량 측광 장치를 기반으로 이러한 한계를 극복하는 접근 방식을 설명합니다. 특히, 미세유체역학 시스템은 질량 광도계와 함께 사용되어 질량 측광으로 정량화할 수 있는 상호 작용의 범위를 효과적으로 확장합니다. Microfluidics는 약한 상호 작용 ^1,9를 검출하기 위하여 급속한 희석을 포함하여 단백질 단백질 상호 작용 조사를 조사하기를 위한 가능성의 범위를 제안하기 위하여 보였습니다. 본원에 기술된 시스템은 미세유체 칩에서 샘플을 최대 10,000배까지 빠르게 희석하고 칩의 관찰 영역을 가로질러 즉시 흐르게 함으로써 작동하며, 분자가 희석 과정⁽¹⁰)을 시작한 시점으로부터 50ms 이내에 질량 측광 측정을 시작할 수 있도록 한다. 희석은 샘플과 완충액이 칩의 역 Tesla 밸브 믹서에서 결합될 때 발생하며, 두 용액의 상대 유속에 따라 발생하는 희석량이 결정됩니다(프로토콜 8단계 참조). 유속은 미세유체 제어 소프트웨어로 제어할 수 있습니다. 유속을 변경하면 질량 광도계로 측정되는 유리 표면의 착륙 이벤트 수에 영향을 줄 수 있으므로 종의 상대적 개체수가 변경될 수 있습니다.

프로세스의 속도는 상호 작용의 무결성이 중단되기 전에 측정을 완료할 수 있을 만큼 충분히 빠릅니다(자세한 내용은 토론 참조). 이것은 1차 반응 이론을 간략하게 살펴보면 이해할 수 있습니다. 순방향(연관성) 속도 상수는 _kf이고, 역방향(해리) 속도 상수는 _kb이며, 평형 해리 상수(KD)는 다음과 같이 정의됩니다.

케이_D= k_b/ k_f

단백질 결합의 경우, _kf는 일반적으로 반응물의 확산(¹¹)에 의해 제한되며, 따라서 10,^6-10,^7M-1·^s-1의 범위로 제한된다. 의 범위가 제한되어 있기 때문에 친화성이 낮은(KD~마이크로몰) 반응은 k_b≈ 1 ^s-1을 갖습니다. 즉, k_b= k_f · K_D = (10^{6 M-1}·^s-1) (10-6 M) = 1 ^s-1, 복합체의 반감기는 약 0.7 s^11,12입니다.

본 예시 시스템은 IgG 단클론 항체 트라스투주맙(trastuzumab)을 상호작용 파트너로 알려진 IgG 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 용해성 도메인에 결합하는 것이다¹³. 기존의 질량 측광법을 단독으로(즉, 샘플의 수동 희석으로) 얻은 이전에 발표된 데이터는 단백질이 여러 종을 형성한다는 것을 보여주었습니다. FcRn 단량체, FcRn 이량체 및 결합되지 않은 IgG를 명확하게 볼 수 있었으며, IgG-FcRn 복합체(1:1 및 1:2 비율)도 검출되었지만(pH 5.0에서) 매우 낮은 농도에서만 검출되었습니다⁵. 이 관찰은 더 높은 농도에서 측정할 경우 IgG-FcRn 복합체 형성이 더 명확하게 검출될 수 있는지에 대한 질문을 제기합니다. 실제로, 여기에 설명된 질량 측광법과 결합된 급속 희석 접근법을 결합하면 측정된 입자의 증가에 의한 복잡한 형성에 대한 보다 강력한 증거를 제공할 수 있습니다.

여기에 설명된 질량 측광 및 미세유체역학 프로토콜은 마이크로몰 범위까지 K_D 를 가진 복합체의 형성을 특성화하는 것을 가능하게 합니다. K_D 의 경험적 측정은 유량 센서 정확도, 펌프 안정성, 칩 간 변동 및 관찰 창 내의 측정 위치에 대한 추가 개선이 필요하며, 이러한 모든 요인이 샘플이 희석된 시점부터 측정까지의 시간에 영향을 미치기 때문입니다.

질량 광도계(30 kDa – 6 MDa)로 분석하기에 적합한 범위에 속하는 고유한 분자량(최소 25kDa로 분리)이 있는 경우 용해성 단백질 간의 결합을 조사하기 위해 동일한 접근 방식을 적용할 수 있습니다. 얻은 통찰력은 세포 기능에 대한 기계론적 이해를 얻는 것부터 새로운 바이오 치료제 설계에 이르기까지 다양한 맥락의 연구에 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

1. 기기 준비 및 소프트웨어 실행 측정을 시작하기 전에 질량 광도계를 켜고 최소 1시간 동안 켜 두십시오.알림: 이는 기기가 일정한 온도에 도달해야 하기 때문입니다. 질량 광도계를 1시간 동안 켜 두지 않으면 질량 이동이 발생하여 부정확한 결과가 발생할 수 있습니다. 전원을 켜고 격리 버튼(질량 광도계 아래)을 눌러 방진 테이블을 켭니다. 진동은 질량 측광 기기의 성능을 제한하므로 진동 방지 테이블은 최대 기기 감도를 보장하는 데 중요합니다. 미세유체역학 상자를 켭니다. 데이터 수집 소프트웨어 및 미세유체공학 제어 소프트웨어를 실행합니다. 공기 압축기를 켭니다. 2. 단백질 샘플, 완충액 및 세척액 준비 깨끗한 200mL 병에 PBS(pH 7.4) 완충액 200mL를 넣고 두 번째 200mL 병에 PBS(pH 5.0) 완충액 200mL를 추가합니다.참고: 200mL 병은 다음 단계에서 “L” 유량 단위 센서에 연결해야 합니다. 보정 측정에는 pH 7.4 PBS 버퍼를 사용하고 샘플 측정에는 pH 5.0 PBS 버퍼를 사용합니다. 0.5mL 원심분리기 튜브에서 IgG(2μM)와 FcRn(20μM)을 1:10 비율로 혼합하여 총 부피 60μL를 만듭니다.FcRn 및 IgG에 대한 원액은 각각 91.9μM 및 13.5μM입니다. 9 μL의 원주 IgG + 13 μL의 원주 FcRn + 38 μL의 PBS(pH 5.0, 실온[RT])를 원심분리 튜브에 총 부피 60 μL로 혼합하여 반응을 준비합니다. 두 반응물의 최종 농도는 IgG의 경우 2μM, FcRn의 경우 20μM였습니다. 이 과정 동안 모든 단백질 스톡을 얼음 위에 유지하십시오. 다른 0.5mL 원심분리기에서 20μM 농도로 β-Amylase 교정제 20μL를 분배합니다.예를 들어, 여기에 사용된 β-아밀라아제 교정제를 준비하려면 2.3.1.1-2.3.1.2에 설명된 절차를 따르십시오.5.6 mg/mL 및 100 μM의 몰 농도 (분자량이 56 kDa이기 때문에)에 해당하는 PBS (5% 글리세롤) 3.57 mL에 있는 작은 유리병에 있는 β 아밀라제 분말의 20 mg를 재탁탁시킵니다. 20μM로 희석하려면 100μM 스톡 200μL를 1mL 원심분리기 튜브에 800μL의 PBS(pH 7.4, RT)와 결합합니다. 샘플을 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다.알림: 질량 광도계를 켠 후 샘플 및 보정 희석액 준비를 시작하십시오. 이 실험을 위해 샘플을 120분 동안 배양했습니다. 50mL 원심분리기 튜브 3개에서 분취액: PBS(pH 7.4) 50mL – 세척 용액 1(CS1), 0.5M NaOH 50mL – 세척 용액 2(CS2) 및 100% IPA 50mL – 세척 용액 3(CS3). 3. 실험 설정 샘플과 교정제를 로드하려면 교정제 원심분리기 튜브를 위치 4에 놓고 시료 원심분리기 튜브를 미세유체역학 상자의 위치 5에 놓습니다(그림 1). 세척 용액을 로드하려면 CS1, CS2 및 CS3을 미세유체 상자의 위치 1, 2 및 3에 놓습니다(그림 1).알림: sample, 교정 및 세척 용액은 다중 스위치(m-스위치)에 연결됩니다. m-스위치는 “S” 유량 단위 센서에 연결됩니다. 버퍼 라인에 연결되는 캡을 200mL(pH 7.4) 버퍼 병에 나사로 고정합니다.알림: 버퍼 라인은 “L” 유량 단위 센서에 연결된 차단 밸브에 연결됩니다. 차단 밸브는 버퍼 흐름이 중지될 때 발생할 수 있는 사이펀 효과를 방지합니다. 사이펀은 완충액 저장소로 되돌아가는 희석된 잔류 유체로부터 완충액의 오염으로 이어질 수 있습니다. 미세유체역학 칩을 준비 플레이트에 놓습니다.”S” 유량 단위 센서의 다른 튜브 끝을 미세유체 칩의 첫 번째 채널의 “Sample Inlet”에 밀어 넣습니다(그림 1). 샘플 라인이 완성되었습니다. “L” 유량 단위 센서의 다른 튜브 끝을 미세유체 칩의 첫 번째 채널의 “버퍼 입구”에 밀어 넣습니다(그림 1). 버퍼 라인이 완성되었습니다. 유출을 수집하려면 미세 유체 칩의 첫 번째 채널의 “출구”로 튜브를 밀어 넣으십시오. 다른 쪽 끝은 폐기물을 수거할 수 있는 플라스크 또는 비커로 배출되도록 배치합니다(그림 1). 4. 버퍼로 샘플 및 버퍼 라인 프라이밍 버퍼 라인의 수동 차단 밸브를 엽니다. 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 버퍼 라인 유량을 1000μL/min으로 설정하고 버퍼 라인 압력이 110mbar를 초과하지 않도록 합니다(그림 2). 흐름은 버퍼 라인에서 자동으로 시작됩니다(그림 1).알림: 버퍼 라인 압력이 110mbar를 초과하는 경우 공기 흐름 센서를 통과하기 때문일 수 있습니다. 압력이 몇 초 내에 정상으로 돌아가지 않으면 잠재적으로 막혔을 수 있습니다(일반적으로 연결부의 튜브가 끼워져 있음). 이 경우 흐름을 중지하고 차단 밸브에서 시작하여 버퍼 라인의 연결을 확인하십시오. 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 m-스위치의 위치 1(PBS 버퍼에 해당)을 선택한 다음 시료 라인 유량을 8μL/min으로 설정하고 시료 라인 압력이 350mbar를 초과하지 않는지 확인합니다. 흐름은 샘플 라인에서 자동으로 시작됩니다(그림 1). 피펫 팁(또는 기타 부드러운 플라스틱 구성 요소)을 사용하여 칩에 갇힌 기포 근처에서 위에서 부드러운 압력을 가하여 기포를 제거하고 배출구를 통해 제거되도록 합니다.알림: 사용 중인 채널의 ‘믹서’ 및 ‘관찰 영역'(그림 1) 섹션에 있는 모든 기포를 제거해야 합니다. 칩이 손상될 수 있으므로 너무 세게 밀지 않도록 주의하십시오. 5. 미세유체역학 칩을 질량 광도계에 놓고 초점을 찾기 질량 광도계의 대물렌즈에 현미경 이멀젼 오일 한 방울을 바릅니다. “Sample Inlet”이 위를 향하도록 하여 질량 광도계의 홀더에 미세유체 칩을 놓고 스테이지 클램프에 부착된 상태로 유지합니다(그림 1). 모든 튜브 연결부가 연결되어 있는지 확인하십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 스테이지를 이동하여 채널 1의 “관찰 영역”이 대물렌즈와 정렬되도록 합니다(그림 1). 질량 광도계 덮개를 닫고 데이터 수집 소프트웨어에서 Droplet-Dilution Find Focus 옵션을 누릅니다. 데이터 수집 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에 있는 흰색 초점 링을 확인합니다(그림 3). 링의 틈은 침지 오일에 공기 방울이 있음을 나타냅니다. 스테이지 속도를 최대로 높이고 스테이지를 부드럽게 움직여 이를 제거하십시오.tage 측면으로. 초점이 완료된 후 첫 번째 녹화를 하기 전에 2-3분 정도 기다립니다. 그런 다음 Record 를 눌러 1분 측정을 기록하고 (측정을 관찰하여) 불순물이 나타나지 않는지 확인합니다.참고: 불순물은 유리 표면이나 완충액에 있을 수 있습니다. 데이터 수집 소프트웨어의 선명도 값은 4.5% 이상이어야 합니다. 6. 질량 측광 교정 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 m-스위치를 위치 4(교정제에 해당)로 전환하고 시료 라인 유량이 8μL/min으로 설정되고 시료 라인 압력이 350mbar를 초과하지 않는지 확인합니다(그림 2).교정제는 칩을 통한 흐름을 시작합니다. 약 1.5-2.5분 동안 기다립니다(또는 데이터 수집 소프트웨어에서 교정제가 일관되게 표시될 때까지). 시간은 샘플 라인 튜빙 길이에 따라 달라질 수 있습니다. 캘리브런트가 일관되게 확인되면(즉, 이벤트 수가 정확한 질량 측광 측정에 충분함) 미세유체 제어 소프트웨어에서 유속을 이 실험의 목표 희석 수준인 0.5μL/min으로 줄입니다.알림: 더 높은 유속으로 시작하면 교정제가 칩에 도달하는 데 필요한 시간이 줄어듭니다. 측정 표면에 “너무 적거나” “너무 많은” 분자가 없는지 확인하십시오(그림 4).착륙 이벤트 밀도가 “이상적”이 아닌 경우(그림 4) 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 유속을 변경하십시오. 이벤트 밀도가 너무 낮으면 잘 분리된 착륙 이벤트가 관찰될 때까지 샘플 유속을 높입니다(단, 8μL/min을 초과하지 않음). 너무 높으면 샘플 유속을 줄이십시오(단, 0.1μL/min 이하로 내려가지 마십시오). 샘플 튜브에서 교정제 부피가 부족하면 공기 주입을 방지하기 위해 m-스위치 위치를 PBS pH 7.4 라인(위치 1)으로 변경합니다. 녹음을 누르고 60초 측정을 합니다. 선택한 폴더에 파일을 저장합니다.참고: 데이터 수집 소프트웨어는 확장자가 .mp인 파일을 생성합니다. 7. 샘플 라인 청소 및 흐름 중지 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 m-스위치의 위치 2로 전환하고 시료 압력을 800mbar로 변경합니다(그림 2). 시스템을 CS2(NaOH)로 4분 동안 세척합니다. m 스위치의 위치 3으로 전환하고 시스템을 CS3(IPA)로 4분 동안 세척합니다. m 스위치의 위치 1로 전환하고 시스템을 CS1(PBS)로 4분 동안 세척합니다. 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 샘플 라인과 버퍼 라인 압력을 0으로 설정하여 모든 흐름을 중지하고 버퍼 밸브를 차단합니다. 스테이지에서 칩을 분리하고 준비 플레이트에 다시 놓습니다. 모든 튜브를 분리하고 샘플 튜브 끝을 폐기물 병에 넣습니다. 이소프로판올과 물티슈로 대물렌즈를 청소하십시오. 8. 질량 측광 샘플 측정 200mL(pH 7.4) 버퍼 병에 연결된 캡을 풀고 200mL(pH 5.0) 버퍼 병에 나사로 고정합니다. 3.4-5.6단계를 반복하되 첫 번째 채널 대신 칩의 두 번째 채널을 사용합니다. 미세유체역학 제어 소프트웨어에서 m-스위치를 위치 5(시료에 해당)로 전환하고, 시료 라인 유속을 8μL/min으로 설정하고, 시료 라인 압력이 350mbar를 초과하지 않도록 합니다(그림 2). 6.2-6.4단계를 반복하여 샘플을 측정합니다.사용할 유속을 계산하려면 유속의 접힘 차이가 원하는 샘플 희석 계수와 일치하는지 확인하십시오. 예를 들어, 여기에서 2000배의 희석을 달성하기 위해 유속은 2000배의 비율로 다릅니다. 완충액 유속은 1000 μL/min이고 시료 유속은 0.5 μL/min입니다. 실험이 끝나면 세척 프로토콜에 따라 항상 라인을 깨끗하게 유지하십시오. 9. 데이터 분석 데이터 수집이 완료되면 데이터 분석 소프트웨어를 실행합니다(그림 5). 왼쪽 상단의 더하기(+) 아이콘을 클릭하고 .mp 보정 파일을 선택합니다. 소프트웨어가로드 된 파일을 분석하기 시작합니다. 측정 크기와 횟수에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다데이터 수집 소프트웨어로 데이터를 수집하는 동안 데이터 분석 소프트웨어에서 .mp 파일을 분석하면 수집되는 데이터의 품질이 저하될 수 있으므로 분석하지 마십시오. Create mass calibration 버튼(오른쪽 하단)을 누릅니다. 맞춤 피크의 대비 값으로 채워진 테이블을 보여주는 대화 상자가 열립니다. 값을 적합 피크에 대해 알려진 질량 값으로 변경하고(β-아밀라아제의 경우 이 값은 56kDa, 112kDa 및 224kDa임) 저장을 누릅니다. 새로 생성된 캘리브레이션 파일(.mc 확장자)이 질량 캘리브레이션 패널(데이터 분석 소프트웨어의 왼쪽 하단)에 나타납니다(그림 6). 왼쪽 위에 있는 더하기(+) 아이콘을 클릭하고 .mp 샘플 파일을 선택합니다. 질량 히스토그램을 생성하려면 그림 5와 같이 Analysis 탭으로 이동하여 Histogram 모드와 질량 플롯 옵션을 선택합니다. 필요에 따라 Bin width, Mass Limits 및 기타 매개변수를 조정합니다. 원하는 경우 Figure를 내보내거나 전체 작업 공간을 .dmp 파일로 저장하기 전에 Figures 탭에서 플롯을 추가로 사용자 지정합니다.

Representative Results

IgG 단클론 항체 트라스투주맙과 IgG 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 용해성 도메인 사이의 상호작용을 측정하기 위해 질량 측광법을 사용했습니다. 두 단백질의 1:10 혼합물(IgG의 경우 2μM, FcRn의 경우 20μM)을 PBS에서 각각 10nM 및 20nM으로 수동으로 희석했습니다. 단일 분자 질량 측정 기법인 질량 측광법은 100 pM-100 nM 범위의 샘플만 분석할 수 있기 때문에 희석 단계가 필요합니다. 이 범위를 벗어난 농도로 시료를 측정하려고 하면 결과의 정확도가 위태로워질 수 있습니다(그림 4). 이 실험은 이전에 5,6에서 설명한 바와 같이 이 프로토콜에 포함되지 않습니다. 질량 측광 실험에서 생성된 질량 히스토그램에서 각 착륙 이벤트에 대한 산란 신호(또는 ‘대비’)의 강도는 x축에 표시되며 질량-대비 보정 단계를 통해 분자량으로 변환됩니다. 한편, y축은 주어진 질량(또는 대비)으로 계산된 분자의 수를 나타냅니다. 따라서 피크는 x축에 표시된 분자량 범위 내에 분자 집단이 존재함을 나타냅니다. 피크를 구성하는 이벤트(개수)의 수는 해당 모집단의 크기를 반영합니다. 수동 희석을 사용한 질량 측광 측정은 단백질의 예상 분자량을 기반으로 두 개의 가장 큰 피크가 결합되지 않은 FcRn 단량체(~50kDa) 및 IgG 항체 단량체(~150kDa)에 해당하는 질량 히스토그램을 생성했습니다(그림 7). 이전에 발표된 질량 측광 데이터5와 유사하게, 결합되지 않은 종은 두드러진 반면, 복합체에 해당하는 질량 범위의 피크는 훨씬 덜 뚜렷했습니다. 질량 측광 측정 직전에 혼합물을 필요한 농도로 희석하기 위해 급속 희석 미세유체 시스템을 사용하여 실험을 반복했습니다. 이 접근 방식을 통해 수동 희석 단계에서 해리되었을 수 있는 추가적인 저친화성 복합체를 검출할 수 있었습니다. 수동 희석 실험에서 사용된 것과 동일한 2000x 희석 계수를 얻기 위해 1:10 샘플 혼합물(IgG의 경우 2μM 농도, FcRn의 경우 20μM 농도)을 1mL/분의 유속으로 PBS 완충액(pH 5.0)과 함께 0.5μL/분의 속도로 미세유체 칩에 흘렸습니다. 측정 시 단백질이 분해되지 않았는지 확인하기 위해 IgG(2μM) 및 FcRn(20μM)은 샘플의 120분 배양 후 미세유체 시스템으로 유동 하에 측정했습니다. 개별 대조군 측정에서는 단백질 분해가 나타나지 않았습니다(보충 그림 1). 급속 희석을 거친 샘플의 경우 FcRn 단량체(53kDa), FcRn 이량체(97kDa) 및 IgG 단량체(148kDa)에 해당하는 피크를 다시 관찰할 수 있었습니다. 또한 196kDa 및 251kDa에서 2개의 추가 피크가 명확하게 관찰되었으며, 이는 1:1 및 1:2 화학량론을 가진 IgG-FcRn 복합체에 해당합니다(그림 7). 이 두 복합체의 예상 질량은 각각 200kDa와 250kDa였습니다. 질량 측정의 변동성은 이 연구에 사용된 질량 광도계의 측정 오차가 ±5 (1:1 복합파의 경우 2%, 1:2 복합파의 경우 0.4%) 내에 있습니다. 급속하게 희석된 샘플에만 이러한 복합체가 존재한다는 것은 이들이 수동 희석 공정에 비해 빠르지만 미세유체 시스템(15)으로 달성된 급속 희석 과정에 비해 느린 속도로 더 낮은 농도에서 해리되는 경향이 있다는 생각과 일치합니다. 그림 1: 미세유체역학과 질량 측광법의 결합. (A,B) 이 프로토콜에 사용된 미세유체역학 상자는 (A) 전면 및 (B) 상단에서 볼 수 있습니다. 세척 용액은 위치 1-3에 배치되고 샘플과 교정제는 위치 4-6에 배치됩니다. 모든 솔루션은 “소형” 유량 단위 센서에 연결된 m-스위치에 연결됩니다. (C) 전체 시스템의 개요. 컴퓨터(왼쪽 상단)는 미세유체 상자(버퍼 및 샘플 튜브에 인접하게 표시)와 미세유체 칩이 있는 질량 광도계(오른쪽 하단)에 연결됩니다. 소형 유량 모니터(FRMS)는 샘플 라인을 통과하는 유량을 모니터링하는 반면, 대형 유량 모니터(FRML)는 버퍼 유량을 모니터링합니다. 시료 및 완충 라인 튜브는 질량 광도계 내부에 위치한 미세유체 칩의 채널에 연결됩니다. (D) 각 칩에는 3개의 채널이 있습니다. FRMS는 샘플 주입구에 연결되고 FRML은 버퍼 주입구에 연결됩니다. 믹서 영역은 빠른 샘플 희석이 이루어지는 곳이고 관찰 영역은 질량 측광 측정이 수행되는 곳입니다. 배출구는 칩에 누출이 없는지 확인하기 위해 추가 유량 센서로 모니터링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 미세유체역학 제어 소프트웨어. 이 소프트웨어를 사용하여 유량, 미세유체역학 시스템의 압력 라인 및 다중 스위치(m-스위치)의 위치를 설정하고 모니터링할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 오일에 기포가 있는지 식별. 데이터 수집 소프트웨어의 예는 선명하고 끊어지지 않는 초점 링(왼쪽)과 ‘깨진’ 링을 보여주며, 이는 이멀젼 오일(오른쪽)에 기포가 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 분자 착륙 이벤트의 수가 너무 적거나, 이상적이거나, 너무 많은 시료 농도의 대표적인 예. 미세유체 칩의 관찰 영역 표면에 착륙하는 분자는 질량 측광 이미지의 비율계량 보기에서 어두운 점으로 나타납니다. 최적으로, 원하는 농도는 데이터 수집 중에 착륙 이벤트의 이상적인 밀도가 발생할 수 있도록 해야 합니다(중간). 착륙 이벤트 밀도가 너무 낮으면(상단, ‘너무 적음’) 질량 측광 데이터의 정확한 통계 분석을 완료할 수 없습니다. 너무 높으면(하단, ‘너무 많음’) 착륙 분자가 공간적으로 겹쳐져 데이터 품질이 저하됩니다. 이 이미지는 질량 광도계를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어로 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 질량 측광을 위한 데이터 분석 소프트웨어의 화면 캡처. 여기에서 데이터 수집 소프트웨어에서 내보낸 .mp 파일을 로드하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 처리된 데이터에서 그림을 생성할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 이 실험에 대한 질량 대비 보정의 화면 캡처. 사용된 교정제는 β-아밀라아제로, 단량체(56kDa), 이량체(112kDa) 및 사량체(224kDa)의 세 가지 종을 형성하는 것으로 알려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 7: 질량 히스토그램은 시료를 빠르게 희석한 후에만 복잡한 형성을 보여줍니다. 수동 희석(주황색) 또는 미세유체HC 시스템(파란색)을 통한 빠른 희석 후 IgG 및 FcRn을 포함하는 시료의 측정에 대해 질량 히스토그램 및 해당 최적 가우스 분포가 표시됩니다. 질량 레이블은 가우스 곡선의 평균값이 급속 희석 후 측정된 질량 히스토그램에 적합함을 나타냅니다. 수동 희석 후 FcRn 단량체(52kDa, 수동 희석으로 측정) 및 IgG 단량체(152kDa)에 해당하는 피크가 관찰되었습니다. 급속 희석 후 FcRn 및 IgG 단량체 외에도 1:1 및 1:2 화학량론을 가진 FcRn 이량체 및 IgG-FcRn 복합체에 해당하는 피크도 명확하게 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 데이터 그림 1: 급속 희석 후 대조군 샘플의 질량 측광 측정은 단백질 분해를 보여주지 않습니다. (A) FcRn-only 샘플에 대한 질량 히스토그램 및 최적 가우스 분포. 급속 희석 전의 초기 시료 농도는 20μM였으며 유속은 0.5μL/min으로 설정되었습니다. FcRn 단량체(53kDa) 및 FcRn 이량체(97kDa)에 해당하는 질량 피크를 관찰할 수 있습니다. (B) IgG(허셉틴) 전용 샘플에 대한 질량 히스토그램 및 최적 가우스 분포. 급속 희석 전의 초기 시료 농도는 2μM였으며 유속은 1μL/min으로 설정되었습니다. IgG 단량체(155kDa)에 해당하는 단일 질량 피크를 관찰할 수 있었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에 설명된 프로토콜은 저친화성 단백질-단백질 상호 작용을 검출하고 정량화하는 방법을 제공합니다. 급속 희석 미세유체 시스템에 결합된 질량 광도계를 사용합니다. 질량 측광법은 30 kDa에서 6 MDa 범위 내의 생체 분자¹⁶에 대한 용액에서 분자 질량을 신뢰성 있게 측정할 수 있는 비표지 생물 분석 도구입니다. 질량 측광법은 샘플을 하나씩 분석하는 단일 분자 기술이므로 일반적으로 100pM-100nM 농도 범위의 샘플로 제한됩니다. 이 범위를 벗어나면 유리 표면에 착륙하는 분자가 공간적으로 겹쳐져 데이터 품질이 저하됩니다. 이 범위 이하에서는 얻은 데이터가 너무 적어 강력한 분석을 수행할 수 없다⁷. 중요한 결과는 단백질 상호 작용에 대한 연구를 해당 범위 내에서 결합 된 종과 결합되지 않은 종의 혼합물을 형성하는 것으로 제한 할 수 있다는 것입니다.

여기에서는 대량 광도계에 적합한 시료 농도 범위를 효과적으로 확장하기 위해 급속 희석 미세유체 시스템을 사용하기 위한 단계별 프로토콜에 대해 자세히 설명했습니다. 미세유체 칩에서 시료를 희석한 다음 50ms 이내에 검출기 관찰 창을 가로질러 흐르게 함으로써 시스템은 상호 작용 평형이 이동하기 전에 희석되지 않은 시료에 존재하는 복합체를 캡처합니다. 샘플은 개별 측정 중에 지속적으로 검출기로 전달됩니다. 이러한 조건에서 복합체의 95%는 샘플을 측정할 때 손상되지 않은 상태로 유지되며, 낮은 친화성 상호 작용의 경우에도 미세몰 순서에 따라 K_D 가 있고 해리 속도가 1 ^s-1만큼 빠릅니다.

이는 다음과 같이 계산할 수 있습니다: 순방향 속도 k_f및 역방향 속도 k_b를 갖는 반응 에 대해,

평형 상태에서는 세 종(A, B 및 복합체 AB)의 농도가 모두 일정하게 유지되므로 및 . 섭동(이 경우 희석)으로 인해 복합체가 해리될 수 있지만 순방향(결합) 반응이 진행되지 않는다는 보수적 가정 하에서 k_f [A] [B]라는 항은 무시할 수 있는 것으로 취급될 수 있으며 다음과 같이 단순화할 수 있습니다.

적분은 평형의 섭동 이후의 시간에 복합체의 농도에 대해 다음과 같은 표현을 제공합니다.

평형의 섭동 후 시간 t 에 묶인 상태로 유지되는 복합체의 비율은 다음과 같습니다.

= 50ms에서 k_b≈ 1 ^s-1과의 반응에 대해 분율 한계는 0.95 또는 95%^11,12입니다.

질량 측광법은 FcRn의 용해성 도메인에 대한 IgG 단클론 항체 trastuzumab의 결합을 조사하기 위해 여기와 이전에⁵ 를 사용했습니다. 2개의 의무적인 파트너는 산성 PH¹⁷에 nanomolar 친화도로 결합하기 위하여 보고되었습니다. 질량 측광법은 결합 파트너가 pH 5.0에 있을 때 형성된 복합체의 풍부도를 정성적으로 평가하는 데 사용되었으며, 샘플은 추가 미세유체 시스템을 통해 빠르게 희석되었습니다. 이 절차는 이전에 보고된 결과를 기반으로 특정 단백질-단백질 상호 작용에 최적화되었습니다⁵. 사용자가 사전 지식이 있거나 사용할 완충액, 초기 단백질 농도, 예상 화학량론, 상호 작용이 평형에 도달하는 데 필요한 배양량과 같은 해당 시스템의 실험 조건을 최적화하는 경우 동일한 절차를 사용하여 다른 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

IgG-FcRn 혼합물을 수동으로 희석했을 때, 이러한 단백질이 상호 작용하는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 IgG-FcRn 복합체의 존재를 감지하기 어려웠습니다⁵. 이 논문은 급속 희석 접근법이 이러한 복합체의 양을 현저히 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 동일한 샘플에 대해 급속 희석을 사용했을 때 1:1 FcRn-IgG 복합체와 2:1 FcRn-IgG 복합체가 모두 명확하게 관찰되었습니다. 복잡한 형성의 이러한 차이는 광범위한 농도에 걸쳐 생체 분자 상호 작용 시스템을 연구하는 것의 중요성을 보여줍니다.

게다가, 이러한 결과는 또한 단일 분자 분석과 함께 미세유체역학을 사용하여 약한 상호 작용을 포착하는 것이 간단하다는 것을 보여줍니다. – 방법의 상당한 격차를 메우는 것. 급속 희석 미세유체역학과 질량 측광법의 조합은 분석 기술로서 질량 측광법의 장점으로 인해 매력적인 이점을 제공합니다. 즉, 질량 측광은 라벨이 필요하지 않고 최소한의 시료 준비만 필요하며 측정은 용액에서 수행됩니다. 이 프로토콜의 경우 질량 측광의 또 다른 주요 이점은 형성된 모든 종을 구별하고 정량화할 수 있다는 것입니다(>30kDa의 고유한 질량을 갖는 경우). 예를 들어, SPR은 결합 및 결합 해제 속도를 측정할 수 있지만 화학량론 정보를 쉽게 제공할 수 없는 것과는 대조적이다⁸.

이 프로토콜과 보다 일반적으로 대량 측광 실험의 경우 몇 가지 고려 사항이 도움이 됩니다. 첫째, 최종 단백질 농도는 질량 측광법이 측정할 수 있는 한계(100 pM-100 nM) 내에 있어야 합니다. 시작 배양 농도는 또한 미세유체 시스템의 범위(최대 90μM) 내에 있어야 하며 상호 작용¹⁰의 실제 K_D보다 높은 것으로 이론화됩니다. 권장되는 시작점은 μM 농도에서 상호 작용하는 종 간의 1:1 농도 혼합 비율입니다. 그런 다음 비율을 1:2, 1:5 또는 이 상호 작용의 경우와 같이 1:10으로 변경할 수 있습니다. 단백질 상호 작용에 대한 이전 정보가 없는 경우 사용자는 구성 요소의 친화도가 제시된 방법에 의해 유지되는 농도 범위 내에 있는지 확인(즉, 복합체가 형성됨)하기 위해 각 파트너에 대해 고농도(권장 20μM)부터 시작하여 실험을 최적화해야 합니다. 최적화에는 올바른 혼합 비율을 결정하기 위해 상호 작용 성분 중 하나의 상호 작용 또는 적정을 촉진하기 위해 다른 완충액 조건을 선택하는 것도 포함될 수 있습니다. 이러한 사항이 결정되면 농도와 흐름을 최적화하여 연구 및 방법에 대한 최적의 조건을 허용할 수 있습니다(예: 더 나은 피크 분리능을 허용하기 위해 농도를 줄이는 것).

둘째, 이 실험을 성공적으로 재현하려면 불순물을 최소화해야 합니다. 질량 측광 측정에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려진 불순물의 일반적인 원인에는 정제 후 남아 있는 다른 단백질 또는 세포 파편, 여과되지 않은 완충액, 미셀 형성 세제(너무 높은 농도로 존재하는 경우) 및 고농도의 염, 글리세롤 또는 기타 성분을 포함하는 완충액이 포함됩니다. 위의 프로토콜에서 논의된 바와 같이 미세유체역학 시스템의 기포를 제거해야 합니다. 튜브 시스템에 기포가 형성되거나 샘플의 표면 장력이 높고 거품이 형성되기 쉬운 경우 기포가 형성될 수 있습니다. 이멀젼 오일에도 기포가 형성될 수 있으며, 이는 초점 링에서 감지할 수 있습니다(그림 3). 프로토콜에 설명된 단계를 사용하여 기포를 제거할 수 없는 경우 또 다른 해결책은 데시케이터와 진공 펌프를 사용하여 샘플의 가스를 제거하고 샘플을 몇 분 동안 감압 상태로 두는 것입니다. 고농축 단백질 용액을 소용돌이치거나 흔드는 것은 기포 형성을 촉진할 수 있으므로 권장되지 않습니다.

하나의 특정 단백질-단백질 상호 작용에 대한 측정이 여기에서 입증되었지만, 동일한 프로토콜을 큰 수정 없이 다른 단백질-단백질 상호 작용 시스템에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 미래 방향은 질량 측광 ^5,7의 맥락에서 다른 곳에서 설명된 바와 같이 식별된 복합체에_{대한 KD 값을} 계산하기 위해 측정값을 사용하는 것입니다. 이전 연구에서는 수동 희석 및 더 강력한 상호 작용과 관련된 실험 데이터를 사용했지만, 미세유체 장치의 추가 개선이 구현되는 경우(예: 유량 센서 정확도 및 펌프 안정성 향상) 분석 원리를 이러한 맥락에서 쉽게 적용할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호 작용 외에도 결합 질량 측광 및 급속 희석 미세유체역학 접근 방식에 대한 더 넓은 응용 분야가 있을 수 있습니다. 질량 측광법은 시료 순도, 응집 및 균질성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다^18,19; 단백질 올리고머화²⁰, 고분자 조립²¹ 또는 중합²²를 연구합니다. 그리고 다른 지역에서. 질량 측광 분석은 단백질에만 국한되지 않습니다. 핵산과 단백질²³, 바이러스 입자²⁴ 및 나노 입자²⁵ 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 결합 질량 측광 미세유체역학 시스템의 중요한 응용 분야를 설명합니다 – 이를 통해 개별 분자 및 복합체 수준에서 약한 단백질-단백질 상호 작용을 직접 측정할 수 있습니다. 본 응용 프로그램의 가치는 일반적으로 연구하기 어려웠던 상호 작용을 직접 특성화할 수 있는 가능성을 열어주기 때문에 매우 높으며, 이는 중요한 치료 영역 전반에 걸쳐 관련성이 있습니다. 이 결합된 접근 방식은 최대 수십 마이크로몰 농도의 샘플에 대한 광범위한 조사의 기초가 될 수도 있습니다.

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Data acquisition software	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Mass photometer	Refeyn	TwoMP
Microfluidics box	Refeyn	MassFluidix HC system
Microfluidics chip	Refeyn	MassFluidix HC chip
Microfluidics control software	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, from sweet potato	Sigma	A8781