Analyse av proteinkompleksdannelse ved mikromolære konsentrasjoner ved kobling av mikrofluidikk med massefotometri

Summary

Denne protokollen kombinerer massefotometri med et nytt mikrofluidikksystem for å undersøke protein-protein-interaksjoner med lav affinitet. Denne tilnærmingen er basert på rask fortynning av høykonsentrerte komplekser i løsning, noe som muliggjør målinger med lav affinitet og utvider anvendeligheten av massefotometri.

Abstract

Massefotometri er en allsidig massemålingsteknologi som muliggjør studier av biomolekylære interaksjoner og kompleks dannelse i løsning uten etiketter. Massefotometri er generelt egnet til å analysere prøver i konsentrasjonsområdet 100 pM-100 nM. I mange biologiske systemer er det imidlertid nødvendig å måle mer konsentrerte prøver for å studere interaksjoner med lav affinitet eller forbigående affinitet. Her demonstrerer vi en metode som effektivt utvider rekkevidden av prøvekonsentrasjoner som kan analyseres ved massefotometri fra nanomolar til titalls mikromolar.

I denne protokollen kombineres massefotometri med et nytt mikrofluidikksystem for å undersøke dannelsen av proteinkomplekser i oppløsning i det mikromolære konsentrasjonsområdet. Med mikrofluidikksystemet kan brukerne opprettholde en prøve ved en ønsket høyere konsentrasjon etterfulgt av fortynning til nanomolærområdet – flere millisekunder før massefotometrimålingen. På grunn av fortynningshastigheten oppnås data før prøvens likevekt har forskjøvet seg (dvs. dissosiasjon av komplekset).

Teknikken brukes til å måle interaksjoner mellom et immunoglobulin G (IgG) antistoff og den neonatale Fc-reseptoren, som viser dannelsen av høyordenskomplekser som ikke var kvantifiserbare med statiske massefotometrimålinger.

Avslutningsvis gjør kombinasjonen av massefotometri og mikrofluidikk det mulig å karakterisere prøver i det mikromolære konsentrasjonsområdet og er dyktig i å måle biomolekylære interaksjoner med svakere affiniteter. Disse evnene kan brukes i en rekke sammenhenger – inkludert utvikling og design av bioterapi – noe som muliggjør grundig karakterisering av ulike protein-protein-interaksjoner.

Introduction

Protein-protein-interaksjoner understreker de fleste cellulære funksjoner, fra immunregulering til DNA-replikasjon og oversettelse. Som et resultat er det et grunnleggende behov i hele biovitenskapen for å undersøke et stort spekter av interaksjoner på tvers av ulike heterogene komplekser som ofte dannes. Imidlertid er deteksjon, karakterisering og kvantifisering ofte utfordrende, spesielt for interaksjoner med lav affinitet¹.

Immunutfellingsanalyser brukes ofte til å oppdage interaksjoner med høy affinitet, men for interaksjoner med lav affinitet og forbigående er deteksjon stort sett ikke mulig². Fluorescensteknikker kan også brukes, men krever potensielt forstyrrende tillegg av fluorescerende etiketter². Cryo-EM kan gi et strukturelt øyeblikksbilde og en ensemblesning av proteinkompleksene dannet med høy romlig oppløsning, men krever også vanligvis arbeid ved konsentrasjoner som er for lave for avbildning av lavaffinitetsinteraksjoner. Cryo-EM gir også utfordringer knyttet til kostnad, tilgjengelighet, prøvepreparering og analysetid³.

I tillegg har overflateplasmonresonans (SPR) blitt en populær måte å kvantifisere protein-protein-interaksjoner på, selv om det krever proteinimmobilisering, noe som kan påvirke bindingslikevekten og resultere i variable frekvenser, og dermed redusere målenøyaktigheten ^4,5. Det innebærer også flere analysetrinn før datainnsamling og analyse⁶.

Massefotometri er en enkeltmolekylteknikk som har blitt brukt til å analysere protein-protein-interaksjoner ^5,6,7. Det fungerer ved å måle massen av enkeltmolekyler eller komplekser basert på lyset de sprer når de lander på overflaten av et glassdeksel⁸. Massefotometrimålinger har blitt brukt til å kvantifisere bindingsaffiniteter fra den relative overflod av bindingspartnere og kompleksene de danner⁵. Likevel, som andre enkeltmolekylteknikker, bør konsentrasjonen av prøven som skal måles, typisk være mindre enn 100 nM. Hvis konsentrasjonen er høyere, vil molekylene som lander på glassoverflaten overlappe romlig, noe som resulterer i dårlig datakvalitet⁷. Følgelig kan svakere interaksjoner (K_D ~ mikromolarer), som dissosieres ved disse lavere konsentrasjonene, ikke måles pålitelig siden det ikke er mulig å observere den nødvendige blandingen av ubundne og bundne arter⁵.

Her beskriver vi en tilnærming som overvinner denne begrensningen basert på en ny koblet mikrofluidikk massefotometri enhet. Spesielt brukes et mikrofluidikksystem i kombinasjon med massefotometeret for effektivt å utvide rekkevidden av interaksjoner som kan kvantifiseres ved massefotometri. Mikrofluidikk har vist seg å tilby en rekke muligheter for å undersøke protein-protein-interaksjoner, inkludert rask fortynning for å oppdage svake interaksjoner ^1,9. Systemet beskrevet her fungerer ved raskt å fortynne prøven opptil 10 000 ganger på en mikrofluidisk chip og umiddelbart strømme den over observasjonsområdet til brikken, slik at massefotometrimålingen kan starte innen 50 ms fra når molekylene begynte fortynningsprosessen¹⁰. Fortynningen skjer når prøven og bufferen kombineres i en omvendt Tesla-ventilblander på brikken, med de relative strømningshastighetene til de to løsningene som bestemmer mengden fortynning som oppstår (se protokolltrinn 8). Strømningshastigheten kan kontrolleres med programvaren for mikrofluidisk kontroll. Endring av strømningshastigheten kan endre den relative populasjonen av arten, da det kan påvirke antall landingshendelser på overflaten av glasset, som er det som måles av massefotometeret.

Prosessens hastighet er rask nok til at målingen kan fullføres før integriteten til samhandlingen har blitt forstyrret (for ytterligere detaljer, se også diskusjonen). Dette kan forstås gjennom en kort titt på teorien om førsteordens reaksjoner, hvor . Forward (assosiasjons) rate konstant er k_f, bakover (dissosiasjon) rate konstant er k_b, og likevektsdissosiasjonskonstanten (K_D) er definert som

K_D = k_b / k_f

For proteinbinding er k_fgenerelt begrenset av reaktantens diffusjon¹¹ og er derfor begrenset til området 10^{6-10 7 M-1} · ^s-1. Fordi rekkevidden av er begrenset, vil en reaksjon med lav affinitet (K_D ~ mikromolarer) ha k_b≈ 1 ^s-1. Det vil si k_b = k_f  · K_D = (10^{6 M-1}·^s-1) (10-6 M) = 1 ^s-1, med kompleksets halveringstid rundt 0,7 s^11,12.

Vårt eksempelsystem er binding av IgG monoklonalt antistoff trastuzumab til løselig domene av IgG neonatal Fc-reseptor (FcRn), som er kjente vekselvirkende partnere¹³. Tidligere publiserte data oppnådd ved bruk av konvensjonell massefotometri alene (dvs. med manuell fortynning av prøver) viste at proteinene danner flere arter. FcRn-monomerer, FcRn-dimerer og ubundet IgG var tydelig synlige, mens IgG-FcRn-komplekser (ved forholdet 1:1 og 1:2) også ble detektert (ved pH 5,0), men bare med svært lav overflod⁵. Denne observasjonen stiller spørsmål ved om dannelsen av IgG-FcRn-komplekser kan oppdages tydeligere hvis den måles i en høyere konsentrasjon. Faktisk ga kombinering av massefotometri med en kombinert rask fortynningstilnærming beskrevet her mer robust bevis på kompleksdannelse ved en økning i deres målte partikler.

Massefotometri- og mikrofluidikkprotokollen beskrevet her gjør det mulig å karakterisere dannelsen av komplekser med en K_{, D} opp til mikromolærområdet. En empirisk bestemmelse av K_D vil kreve ytterligere forbedringer på strømningssensorens nøyaktighet, pumpestabilitet, chip-to-chip-variasjoner og måleplassering inne i observasjonsvinduet, da alle disse faktorene vil påvirke tiden fra prøven fortynnes til den måles.

Den samme tilnærmingen kan brukes til å undersøke binding blant oppløselige proteiner, forutsatt at de har forskjellige molekylvekter (separert med minst 25 kDa) som faller inn i området som er egnet for analyse med et massefotometer (30 kDa til 6 MDa). Innsikten som er oppnådd, kan være nyttig for studier i en rekke sammenhenger – fra å få en mekanistisk forståelse av cellulære funksjoner til utforming av nye bioterapeutiske stoffer.

Protocol

1. Klargjøre instrumentene og starte programvaren Slå på massefotometeret og la det være på i minst 1 time før du starter noen målinger.MERK: Dette er fordi instrumentet må nå en konstant temperatur. Hvis du ikke lar massefotometeret stå på i 1 time, kan det føre til masseforskyvning og derfor unøyaktige resultater. Slå på antivibrasjonsbordet ved å slå på strømmen og trykke på isolasjonsknappen (under massefotometeret). Vibrasjoner begrenser ytelsen til massefotometriinstrumentet, så antivibrasjonstabellen er viktig for å sikre maksimal instrumentfølsomhet. Slå på mikrofluidikkboksen. Start datainnsamlingsprogramvaren og programvaren for mikrofluidikkkontroll. Slå på luftkompressoren. 2. Klargjøre proteinprøver, buffer og rengjøringsløsninger Tilsett 200 ml PBS (pH 7,4) buffer til en ren 200 ml flaske og 200 ml PBS (pH 5,0) buffer til en annen 200 ml flaske.MERK: Flaskene på 200 ml må kobles til sensoren “L” Flow Unit i de neste trinnene. Bruk pH 7,4 PBS-buffer for kalibreringsmåling og pH 5,0 PBS-buffer for prøvemåling. I et 0,5 ml sentrifugerør blander du IgG (2 μM) og FcRn (20 μM) i forholdet 1:10 for et totalvolum på 60 μL.Stamløsningene for FcRn og IgG er henholdsvis 91,9 μM og 13,5 μM. Forbered reaksjonen ved å blande 9 μL av stamlager IgG + 13 μL av lager FcRn + 38 μL PBS (pH 5,0, romtemperatur [RT]) i et sentrifugerør for et totalt volum på 60 μL. De endelige konsentrasjonene for de to reaktantene var 2 μM for IgG og 20 μM for FcRn. Hold alle proteinlagre på is gjennom hele denne prosessen. I et annet 0,5 ml sentrifugerør dispenserer 20 μL av β-Amylase-kalibranten ved 20 μM konsentrasjon.For eksempel, for å forberede β-Amylase-kaliberet som brukes her, følg prosedyren beskrevet i 2.3.1.1-2.3.1.2.Godt 20 mg β-amylasepulver i hetteglasset i 3,57 ml PBS (5 % glyserol), tilsvarende 5,6 mg/ml og en molarkonsentrasjon på 100 μM (da molekylvekten er 56 kDa). For å fortynne til 20 μM, kombiner 200 μL av 100 μM-stampinnen med 800 μL PBS (pH 7,4, RT) i et 1 ml sentrifugerør. Inkuber prøvene ved RT i minst 30 minutter.MERK: Begynn å klargjøre prøven og kalibrantfortynningene etter at du har slått på massefotometeret. For dette eksperimentet ble prøvene inkubert i 120 minutter. I tre 50 ml sentrifugerør, alikot: 50 ml PBS (pH 7,4) – rengjøringsløsning 1 (CS1), 50 ml 0,5 M NaOH – rengjøringsløsning 2 (CS2) og 50 ml 100% IPA – rengjøringsløsning 3 (CS3). 3. Eksperimentelt oppsett For å laste prøven og kalibranten, plasser kalibersentrifugerøret i posisjon 4 og prøvesentrifugerøret i posisjon 5 i mikrofluidikkboksen (figur 1). For å fylle rengjøringsløsningene, plasser CS1, CS2 og CS3 i posisjon 1, 2 og 3 i boksen for mikrofluidikk (figur 1).MERK: Prøve-, kalibrant- og rengjøringsløsningene er koblet til multibryteren (m-bryteren). M-bryteren er koblet til sensoren “S” strømningsenhet. Skru korken som kobles til bufferledningen på bufferflasken på 200 ml (pH 7,4).MERK: Bufferledningen er koblet til en avstengningsventil, som er koblet til “L” strømningsenhetssensoren. Avstengningsventilen forhindrer eventuelle siphoning-effekter som kan oppstå når bufferstrømmen stoppes. Siphoning kan føre til at bufferen fra den fortynnede restvæsken kommer tilbake til bufferreservoaret. Legg mikrofluidikkbrikken på en forberedelsesplate.Skyv den andre rørenden av “S”-strømningsenhetssensoren inn i “Prøveinnløpet” til den første kanalen i mikrofluidikkbrikken (figur 1). Eksempellinjen er fullført. Skyv den andre rørenden av “L”-strømningsenhetssensoren inn i “bufferinnløpet” til den første kanalen i mikrofluidikkbrikken (figur 1). Bufferlinjen er fullført. For å samle utstrømningen, skyv et rør til “Utløpet” til den første kanalen i mikrofluidikkbrikken; Plasser den andre enden slik at den renner ned i en mottakelig kolbe eller beger for avfall (figur 1). 4. Priming av prøve- og bufferlinjene med buffer Åpne den manuelle avstengningsventilen på bufferledningen. I programvaren for kontroll av mikrofluidikk setter du bufferlinjestrømningshastigheten til 1000 μL/min og sørger for at bufferlinjetrykket ikke overstiger 110 mbar (figur 2). Flyten starter automatisk i bufferlinjen (figur 1).MERK: Hvis bufferlinjetrykket overstiger 110 mbar, kan det skyldes luft som passerer gjennom strømningssensoren. Hvis trykket ikke går tilbake til det normale i løpet av få sekunder, er det potensielt en blokkering (vanligvis på grunn av klemt slange ved tilkoblingene). I så fall stopper du strømmen og kontrollerer tilkoblingene i bufferlinjen, og starter ved avstengningsventilen. I programvaren for kontroll av mikrofluidikk velger du posisjon 1 på m-bryteren (tilsvarer PBS-bufferen), setter deretter prøvelinjestrømningshastigheten til 8 μL/min og sørger for at trykket i prøveledningen ikke overstiger 350 mbar. Flyten starter automatisk i prøvelinjen (figur 1). Bruk en pipettespiss (eller annen myk plastkomponent) til å påføre et lett trykk ovenfra nær boblen(e) som er fanget i brikken, for å løsne luftbobler og sørge for at de fjernes gjennom utløpet.MERK: Sørg for å fjerne alle boblene i delene “mikser” og “observasjonsområde” (figur 1) i kanalen som brukes. Pass på at du ikke presser for hardt, da dette kan skade brikken. 5. Plasser mikrofluidikkbrikken på massefotometeret og finn fokus Påfør en dråpe mikroskop nedsenkningsolje på målet med massefotometeret. Plasser mikrofluidikkbrikken på holderen til massefotometeret med “Sample Inlet” vendt opp og hold den festet til sceneklemmene (figur 1). Forsikre deg om at alle slangetilkoblinger forblir festet. Bruk datainnsamlingsprogramvaren til å flytte scenen for å sikre at “Observasjonsområdet” på kanal 1 er på linje med målet (figur 1). Lukk massefotometerlokket og trykk på alternativet Dråpefortynning Finn fokus i datainnsamlingsprogramvaren. Sjekk den hvite fokusringen nederst til venstre i programvaren for datainnsamling (figur 3). Hull i ringen indikerer tilstedeværelsen av en luftboble i nedsenkningsoljen; Fjern dette ved å øke scenehastigheten til maksimum og forsiktig flytte scenen sideveis. Etter at fokuseringen er fullført, vent 2-3 min før du tar det første opptaket. Trykk deretter på Record for å registrere en 1 min måling og sørg (ved å observere målingen) at ingen urenheter vises.MERK: Urenheter kan være på glassoverflaten eller i bufferen. Skarphetsverdien i datainnsamlingsprogramvaren skal være over 4.5%. 6. Kalibrering av massefotometri I programvaren for kontroll av mikrofluidikk bytter du m-bryteren til posisjon 4 (tilsvarer kalibranten) og sørger for at strømningshastigheten for prøvelinjen er satt til 8 μL/min og at trykket på prøvelinjen ikke overstiger 350 mbar (figur 2).Kalibranten vil starte strømmen gjennom brikken. Vent ca. 1,5–2,5 min (eller til kaliberet ses konsekvent på datainnsamlingsprogramvaren). Tiden kan variere basert på lengden på prøvelinjens rør. Når kalibranten er sett konsekvent (dvs. antall hendelser er tilstrekkelig for en nøyaktig massefotometrimåling), reduserer du strømningshastigheten til 0,5 μL / min i mikrofluidikkkontrollprogramvaren – målfortynningsnivået for dette eksperimentet.MERK: Å begynne med en høyere strømningshastighet reduserer ganske enkelt tiden det tar for kaliberet å nå brikken. Pass på at det ikke er “for få” eller “for mange” molekyler som lander på måleflaten (figur 4).Hvis landingshendelsestettheten ikke er “ideell” (figur 4), endrer du strømningshastigheten i programvaren for kontroll av mikrofluidikk. Hvis hendelsestettheten er for lav, øk prøvestrømningshastigheten til godt separerte landingshendelser er observert (men ikke overstige 8 μL/min). Hvis den er for høy, reduser prøvestrømningshastigheten (men ikke gå under 0,1 μL/min). Hvis kalibervolumet begynner å bli lavt i prøvebeholderen, endrer du m-bryterposisjonen til PBS pH 7,4-linjen (posisjon 1) for å unngå å injisere luft. Trykk på Record og ta en 60 s-måling . Lagre filen i en valgt mappe.MERK: Datainnsamlingsprogramvaren produserer filer med .mp som utvidelse. 7. Rengjør prøvelinjen og stopper strømmen I kontrollprogramvaren for mikrofluidikk, bytt til posisjon 2 på m-bryteren og endre prøvetrykket til 800 mbar (figur 2). Skyll systemet med CS2 (NaOH) i 4 minutter. Bytt til posisjon 3 på m-bryteren og skyll systemet med CS3 (IPA) i 4 minutter. Bytt til posisjon 1 på m-bryteren og skyll systemet med CS1 (PBS) i 4 minutter. I programvaren for kontroll av mikrofluidikk stopper du all strømning ved å sette prøvelednings- og bufferlinjetrykket til 0 og slå av bufferventilen. Koble brikken fra scenen og legg den tilbake på forberedelsesplaten. Koble fra alle slanger og plasser prøveslangenden i en avfallsflaske. Rengjør objektivet med isopropanol og våtservietter. 8. Måling av massefotometriprøven Skru av korken som er koblet til bufferflasken på 200 ml (pH 7,4), og skru den fast på bufferflasken på 200 ml (pH 5,0). Gjenta trinn 3.4-5.6, men bruk den andre kanalen i brikken i stedet for den første. I programvaren for kontroll av mikrofluidikk bytter du m-bryteren til posisjon 5 (tilsvarer prøven), setter strømningshastigheten for prøvelinjen til 8 μL/min, og sørger for at trykket på prøvelinjen ikke overstiger 350 mbar (figur 2). Gjenta trinn 6.2-6.4 for å måle prøven.For å beregne strømningshastighetene som skal brukes, må du sørge for at foldforskjellen i strømningshastighet samsvarer med ønsket fortynningsfaktor for prøven. For eksempel, for å oppnå fortynning av 2000x her, varierer strømningshastighetene med en faktor på 2000; bufferstrømningshastigheten er 1000 μL/min, og prøvestrømningshastigheten er 0,5 μL/min. På slutten av et eksperiment må du alltid la linjene være rene ved å følge rengjøringsprotokollen. 9. Analyse av data Når innsamlingen av data er ferdig, start dataanalyseprogramvaren (figur 5). Klikk på plussikonet (+) øverst til venstre og velg .mp-kaliberrantfilen. Programvaren vil begynne å analysere den lastede filen. Avhengig av størrelse og antall målinger, kan dette ta noen minutterIkke analyser MP-filer i dataanalyseprogramvaren mens du henter data med datainnsamlingsprogramvare, fordi dette kan redusere kvaliteten på dataene som anskaffes. Trykk på knappen Opprett massekalibrering (nederst til høyre). En dialogboks åpnes som viser et bord fylt med kontrastverdiene til de monterte toppene. Endre verdiene til de kjente masseverdiene for de tilpassede toppene (for β-amylase er disse verdiene 56 kDa, 112 kDa og 224 kDa) og trykk Lagre. Den nyopprettede kalibreringsfilen (filtypen .mc) vises på massekalibreringspanelet (nederst til venstre i dataanalyseprogramvaren) (figur 6). Klikk på plussikonet (+) øverst til venstre, og velg MP-eksempelfilen. For å lage et massehistogram, som vist i figur 5, gå til kategorien Analyse , velg histogrammodus og alternativet Masseplott . Juster hyllebredden, massegrensene og andre parametere etter behov. Tilpass plottet ytterligere i fanen Figurer om ønskelig før du eksporterer tall og/eller lagrer hele arbeidsområdet som en .dmp fil.

Representative Results

Massefotometri ble brukt for å måle interaksjonen mellom IgG monoklonalt antistoff trastuzumab og det løselige domenet til IgG neonatal Fc-reseptor (FcRn). En 1:10-blanding av de to proteinene (ved 2 μM for IgG og 20 μM for FcRn) ble fortynnet manuelt til henholdsvis 10 nM og 20 nM i PBS. Fortynningstrinnet er nødvendig fordi massefotometri, en enkeltmolekylær massemålingsteknikk, bare kan analysere prøver i 100 pM-100 nM-området. Forsøk på å måle prøver med konsentrasjoner utenfor dette området kan skade nøyaktigheten av resultatene (figur 4). Dette eksperimentet er ikke inkludert i denne protokollen, da det tidligere er beskrevet 5,6. I massehistogrammene produsert i et massefotometrieksperiment plottes styrken til spredningssignalet (eller ‘kontrasten’) for hver landingshendelse på x-aksen, og den konverteres til molekylær masse via kalibreringstrinnet med massekontrast. I mellomtiden indikerer y-aksen antall molekyler telt med en gitt masse (eller kontrast). Derfor indikerer en topp tilstedeværelsen av en populasjon av molekyler innenfor molekylvektområdet vist på x-aksen. Antall hendelser (tellinger) som utgjør toppen, gjenspeiler størrelsen på populasjonen. Massefotometrimålingen med manuell fortynning resulterte i et massehistogram der de to største toppene, basert på proteinenes forventede molekylvekt, tilsvarte ubundne FcRn-monomerer (~50 kDa) og IgG-antistoffmonomerer (~150 kDa) (figur 7). I likhet med de tidligere publiserte massefotometridataene5 var de ubundne artene fremtredende, mens toppene i masseområdene som ville tilsvare komplekser var mye mindre tydelige. Forsøket ble gjentatt ved hjelp av et hurtigfortynnende mikrofluidikksystem for å fortynne blandingen til den nødvendige konsentrasjonen umiddelbart før massefotometrimålingen. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å oppdage ytterligere komplekser med lav affinitet, som kan ha dissosiert under det manuelle fortynningstrinnet. For å oppnå den samme 2000x fortynningsfaktoren som ble brukt under det manuelle fortynningseksperimentet, ble 1:10-prøveblandingen (ved 2 μM-konsentrasjon for IgG og 20 μM for FcRn) strømmet inn på mikrofluidbrikken med en hastighet på 0,5 μL/min, sammen med PBS-buffer (pH 5,0) ved en strømningshastighet på 1 ml/min. For å sikre at proteinene ikke ble nedbrutt på måletidspunktet, ble IgG (2 μM) og FcRn (20 μM) målt under strømning med mikrofluidikksystemet etter 120 min inkubasjon av prøvene. Individuelle kontrollmålinger viste ingen proteinnedbrytning (tilleggsfigur 1) For prøven som gjennomgikk rask fortynning, kunne toppene tilsvarende FcRn-monomerer (53 kDa), FcRn-dimerer (97 kDa) og IgG-monomerer (148 kDa) igjen observeres. I tillegg ble ytterligere to topper tydelig observert ved 196 kDa og 251 kDa, tilsvarende IgG-FcRn-komplekser med støkiometrier på 1:1 og 1:2 (figur 7). De forventede massene for disse to kompleksene var henholdsvis 200 kDa og 250 kDa. Variasjonen i massemåling er innenfor målefeilen for massefotometeret som brukes i denne studien er ±5 (2% for 1:1-komplekset og 0,4% for 1:2-komplekset). Tilstedeværelsen av disse kompleksene i bare den raskt fortynnede prøven er i samsvar med ideen om at de har en tendens til å dissociere ved lavere konsentrasjoner, med en hastighet som er rask i forhold til en manuell fortynningsprosess, men langsom i forhold til prosessen med rask fortynning oppnådd med mikrofluidikksystemet15. Figur 1: Kombinere mikrofluidikk med massefotometri. (A,B) Mikrofluidikkboksen som brukes i denne protokollen, sett fra (A)-fronten og (B)-toppen. Rengjøringsløsningene er plassert i posisjonene 1-3, og prøvene og kalibrantene i posisjonene 4-6. Alle løsninger er koblet til m-bryteren, som er koblet til sensoren “Small” flow unit. (C) Oversikt over hele systemet. Datamaskinen (øverst til venstre) er koblet til mikrofluidikkboksen (vist ved siden av buffer- og prøverørene) og massefotometeret (nederst til høyre), der mikrofluidikkbrikken er plassert. Den lille strømningshastighetsmonitoren (FRMS) overvåker strømmen gjennom prøvelinjen, mens den store strømningshastighetsmonitoren (FRML) overvåker bufferstrømmen. Prøve- og bufferlinjerøret kobles til en kanal på mikrofluidikkbrikken, plassert inne i massefotometeret. (D) Hver brikke har tre kanaler. FRMS er koblet til prøveinnløpet og FRML til bufferinnløpet. Blandeområdet er der rask prøvefortynning finner sted, mens observasjonsområdet er der massefotometrimålingene gjøres. Uttaket overvåkes av en ekstra strømningssensor for å sikre at det ikke er lekkasjer i brikken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Kontrollprogramvaren for mikrofluidikk. Med denne programvaren kan du stille inn og overvåke strømningshastighetene, trykkledningene til mikrofluidikksystemet og posisjonen til multibryteren (m-bryteren). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Identifisere tilstedeværelsen av bobler i oljen. Eksemplene fra datainnsamlingsprogramvaren viser en klar, ubrutt fokusring (venstre) og en “ødelagt” ring, noe som indikerer tilstedeværelsen av luftbobler i nedsenkningsoljen (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Representative eksempler på prøvekonsentrasjoner der antall molekyllandingshendelser er for få, ideelle eller for mange. Molekyler som lander på overflaten av observasjonsområdet i mikrofluidikkbrikken vil vises som mørke flekker i det ratiometriske bildet av massefotometribildet. Optimalt bør den ønskede konsentrasjonen gjøre det mulig for en ideell tetthet av landingshendelser å finne sted under datainnsamling (midten). Hvis tettheten av landingshendelser er for lav (øverst, ‘For få’), kan ikke nøyaktig statistisk analyse av massefotometridataene fullføres. Hvis den er for høy (nederst, ‘For mange’), vil landingsmolekylene overlappe romlig, noe som vil resultere i dårlig datakvalitet. Disse bildene ble tatt med datainnsamlingsprogramvaren ved hjelp av et massefotometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Et skjermbilde av dataanalyseprogramvaren for massefotometri. Her kan .mp-filene eksportert fra datainnsamlingsprogramvaren lastes inn for å analysere dataene. Tall kan genereres fra de bearbeidede dataene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Et skjermbilde av massekontrastkalibreringen for dette eksperimentet. Kaliberet som ble brukt var β-Amylase, som er kjent for å danne tre arter: monomer (56 kDa), dimer (112 kDa) og tetramer (224 kDa). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 7: Massehistogrammer viser kompleksdannelse først etter rask prøvefortynning. Massehistogrammer og tilsvarende gaussfordelinger med best tilpasning er vist for målinger av prøver som inneholder IgG og FcRn etter manuell fortynning (oransje) eller rask fortynning via microfluidicsHC-systemet (blått). Masseetikettene indikerer at middelverdiene fra de gaussiske kurvene passer til massehistogrammene målt etter rask fortynning. Etter manuell fortynning ble det observert toppverdier tilsvarende FcRn-monomerer (52 kDa, målt med manuell fortynning) og IgG-monomerer (152 kDa). Etter rask fortynning, i tillegg til FcRn- og IgG-monomerene, ble det også tydelig observert topper tilsvarende FcRn-dimerer og IgG-FcRn-komplekser med støkiometri 1:1 og 1:2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Supplerende data Figur 1: Massefotometrimålinger av kontrollprøver etter rask fortynning viser ingen proteinnedbrytning. (A) Massehistogram og gaussisk fordeling som passer best for bare FcRn-prøven. Den opprinnelige prøvekonsentrasjonen før rask fortynning var 20 μM, og strømningshastigheten ble satt til 0,5 μL/min. Massetopper tilsvarende FcRn-monomerer (53 kDa) og FcRn-dimerer (97 kDa) kunne observeres. (B) Massehistogram og best egnet gaussisk fordeling for IgG (Herceptin) bare prøven. Den opprinnelige prøvekonsentrasjonen før rask fortynning var 2 μM, og strømningshastigheten ble satt til 1 μL/min. En enkelt massetopp tilsvarende IgG-monomer (155 kDa) kunne observeres. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Protokollen som er skissert her, gir en metode for å oppdage og kvantifisere protein-protein-interaksjoner med lav affinitet. Den bruker et massefotometer koblet til et hurtigfortynnende mikrofluidikksystem. Massefotometri er et etikettfritt, bioanalytisk verktøy som pålitelig kan måle molekylær masse i løsning for biomolekyler¹⁶, for de innenfor området 30 kDa til 6 MDa. Siden massefotometri er en enkeltmolekylteknikk som analyserer prøver en etter en, er den generelt begrenset til prøver i konsentrasjonsområdet 100 pM-100 nM. Over dette området vil molekylene som lander på glassoverflaten overlappe romlig, noe som resulterer i dårlig datakvalitet; Under dette området oppnås for lite data til å gjøre robust analyse⁷. En viktig konsekvens er at det kan begrense undersøkelsen av proteininteraksjoner til de som danner en blanding av bundne og ubundne arter innenfor dette området.

Her detaljerte vi en trinnvis protokoll for bruk av et hurtigfortynnende mikrofluidikksystem for effektivt å utvide rekkevidden av prøvekonsentrasjoner som er mottagelige for massefotometri. Ved å fortynne prøven på den mikrofluidiske brikken og deretter strømme den over detektorobservasjonsvinduet innen 50 ms, fanger systemet kompleksene som er tilstede i den ufortynnede prøven før interaksjonslikevekten skifter. Prøven leveres kontinuerlig til detektoren under individuelle målinger. Under disse forholdene vil 95% av komplekset forbli intakt når prøven måles, selv for lavaffinitetsinteraksjoner – med en K_D i størrelsesorden mikromolarer og dissosiasjonshastigheter så raskt som 1 ^s-1.

Dette kan beregnes som følger: For en reaksjon med en terminrente k_fog bakoverkurs k_b,

Ved likevekt forblir konsentrasjonene av alle tre artene (A, B og komplekset AB) konstant, så og . Under den konservative antagelsen om at forstyrrelsen (fortynning, i dette tilfellet) kan føre til at komplekset dissosierer, men den fremre (assosiasjons) reaksjonen ikke fortsetter, kan begrepet k_f [A] [B] behandles som ubetydelig, og følgende forenkling kan gjøres:

Integrering gir følgende uttrykk for konsentrasjonen av kompleks på tid etter forstyrrelse av likevekt:

Fraksjonen av komplekset som forblir bundet på tidspunkt t etter forstyrrelsen av likevekt er således:

Ved = 50 ms, for en reaksjon med k_b≈ 1 ^s-1, er fraksjonen bundet 0,95 eller 95%^11,12.

Her og tidligere⁵ ble massefotometri brukt for å undersøke bindingen av det monoklonale antistoffet IgG trastuzumab til det løselige domenet til FcRn. De to bindingspartnerne er rapportert å binde seg med nanomolar affinitet ved sur pH¹⁷. Massefotometri ble brukt til å kvalitativt vurdere overflod av kompleksene som ble dannet mens bindingspartnerne var ved pH 5,0, og prøvene ble raskt fortynnet gjennom et ekstra mikrofluidisk system. Prosedyren ble optimalisert for den spesielle protein-protein-interaksjonen basert på tidligere rapporterte resultater⁵. Den samme prosedyren kan brukes til å studere andre interaksjoner, forutsatt at brukerne har forkunnskaper eller optimaliserer de eksperimentelle forholdene for det aktuelle systemet, for eksempel hvilke buffere som skal brukes, den opprinnelige proteinkonsentrasjonen, forventet støkiometri og mengden inkubasjon som trengs for å tillate samspillet å nå en likevekt.

Når IgG-FcRn-blandingen ble fortynnet manuelt, var det vanskelig å påvise tilstedeværelse av IgG-FcRn-komplekser, selv om disse proteinene er kjent for å interagere⁵. Denne artikkelen viser at den raske fortynningsmetoden resulterer i en betydelig økt mengde av disse kompleksene. For den samme prøven, når rask fortynning ble brukt, ble både 1: 1 FcRn-IgG-komplekser og 2: 1 FcRn-IgG-komplekser tydelig observert. Disse forskjellene i kompleks dannelse demonstrerer viktigheten av å studere biomolekylære interaksjonssystemer over et bredt spekter av konsentrasjoner.

I tillegg viser disse resultatene også at det er enkelt å bruke mikrofluidikk med enkeltmolekylanalyse for å fange svake interaksjoner – fylle et betydelig gap i metoden. Kombinasjonen av hurtigfortynnende mikrofluidikk med massefotometri gir attraktive fordeler på grunn av fordelene med massefotometri som analytisk teknikk. Det vil si at massefotometri ikke krever etiketter, innebærer minimal prøvepreparering, og målingene gjøres i løsning. For denne protokollen er en annen viktig fordel ved massefotometri dens evne til å skille og kvantifisere alle artene som dannes (forutsatt at de har en distinkt masse på >30 kDa). Dette er i motsetning til for eksempel SPR, som kan måle bindings- og ubindingshastigheter, men ikke lett kan gi støkiometriinformasjon⁸.

For denne protokollen, så vel som massefotometrieksperimenter mer generelt, er flere hensyn nyttige. For det første bør den endelige proteinkonsentrasjonen ligge innenfor grensen for hva massefotometri kan måle (100 pM-100 nM). Startinkubasjonskonsentrasjonen bør også være innenfor området for det mikrofluidiske systemet (opptil 90 μM) og teoretiseres til å være over den faktiske K_D av interaksjonen¹⁰. Det anbefalte utgangspunktet er et blandingsforhold på 1:1 mellom de vekselvirkende artene ved μM-konsentrasjon. Forholdet kan da varieres til 1:2, 1:5, eller, som i tilfellet med denne interaksjonen, 1:10. Hvis det ikke er noen tidligere informasjon om proteininteraksjonene, må brukeren optimalisere eksperimentet, med utgangspunkt i en høy konsentrasjon (anbefalt 20 μM) for hver partner for å avgjøre om affiniteten til komponentene er innenfor konsentrasjonsområdet opprettholdt av metoden presentert (dvs. komplekser dannes). Optimalisering kan også innebære å velge andre bufferbetingelser for å fremme interaksjoner eller titrering av en av interaksjonskomponentene for å bestemme riktig blandingsforhold. Når disse er bestemt, er det mulig å optimalisere konsentrasjoner og strømmer for å tillate optimale forhold for studien og metoden, for eksempel å redusere konsentrasjonene for å muliggjøre bedre toppoppløsning.

For det andre, for å kunne replikere dette eksperimentet, bør urenheter minimeres. Vanlige kilder til urenheter som er kjent for å påvirke massefotometrimålinger negativt, inkluderer andre proteiner eller cellulært rusk som forblir etter rensing, ufiltrerte buffere, micelledannende vaskemidler (hvis de er tilstede i for høy konsentrasjon) og buffere som inneholder høye konsentrasjoner av salt, glyserol eller andre komponenter. Som omtalt i protokollen ovenfor, bør bobler i mikrofluidikksystemet fjernes. Bobler kan dannes i slangesystemet eller hvis prøvene har høy overflatespenning og er utsatt for skumdannelse. Det kan også dannes bobler i nedsenkningsoljen, som kan påvises fra fokusringen (figur 3). Hvis bobler ikke kan fjernes ved hjelp av trinnene beskrevet i protokollen, er en annen løsning å degas prøven ved hjelp av en tørketrommel og en vakuumpumpe, slik at prøven blir redusert i noen minutter. Vortexing eller risting av høykonsentrerte proteinløsninger anbefales ikke, da disse virkningene kan fremme bobledannelse.

Mens måling av en spesifikk protein-protein-interaksjon er demonstrert her, kan den samme protokollen brukes på andre protein-protein-interaksjonssystemer uten signifikant modifikasjon. En videre fremtidig retning av denne protokollen vil være å bruke målingene til å beregne_KD-verdier for kompleksene som er identifisert, som det har blitt beskrevet andre steder i sammenheng med massefotometri ^5,7. Mens de tidligere studiene brukte data fra eksperimenter som involverte manuell fortynning og sterkere interaksjoner, kunne analyseprinsippet lett brukes i denne sammenhengen – forutsatt at ytterligere forbedringer i den mikrofluidiske enheten implementeres (for eksempel økt strømningssensornøyaktighet og pumpestabilitet).

Utover protein-protein-interaksjoner vil det sannsynligvis være bredere anvendelser for kombinert massefotometri og hurtigfortynning mikrofluidikk tilnærming. Massefotometri kan brukes til å vurdere prøvens renhet, aggregering og homogenitet^18,19; studere protein oligomerisering²⁰, makromolekylær montering²¹ eller polymerisering²²; og på andre områder. Massefotometrianalyse strekker seg også utover proteiner; Det har blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom nukleinsyrer og proteiner²³, virale partikler²⁴ og nanopartikler²⁵. Denne protokollen beskriver dermed en viktig anvendelse av et kombinert massefotometri mikrofluidikksystem – det muliggjør direkte måling av svake protein-protein-interaksjoner på nivået av individuelle molekyler og komplekser. Verdien av den foreliggende anvendelsen er høy, da den åpner muligheten for enkel karakterisering av interaksjoner som generelt har vært vanskelige å studere – med relevans på tvers av kritiske terapeutiske områder. Denne kombinerte tilnærmingen kan også tjene som grunnlag for et bredere spekter av undersøkelser for prøver med konsentrasjoner opp til titalls mikromolar.

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Data acquisition software	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Mass photometer	Refeyn	TwoMP
Microfluidics box	Refeyn	MassFluidix HC system
Microfluidics chip	Refeyn	MassFluidix HC chip
Microfluidics control software	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, from sweet potato	Sigma	A8781