Brug af Drosophila larve neuromuskulær junction og muskelceller til at visualisere mikrotubulus netværk

Summary

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til visualisering af mikrotubulusnetværkene i neuromuskulære kryds og muskelceller. Kombineret med de kraftfulde genetiske værktøjer i Drosophila melanogaster letter denne protokol i høj grad genetisk screening og mikrotubulus-dynamikanalyse for mikrotubulusnetværksregulerende proteiners rolle i nervesystemet.

Abstract

Mikrotubulusnetværket er en væsentlig bestanddel af nervesystemet. Mutationer i mange mikrotubuli regulatoriske proteiner er forbundet med neurodevelopmental lidelser og neurologiske sygdomme, såsom mikrotubulus-associeret protein Tau til neurodegenerative sygdomme, mikrotubulus skæreprotein Spastin og Katanin 60 forårsager henholdsvis arvelige spastiske paraplegi og neurodevelopmental abnormiteter. Påvisning af mikrotubulusnetværk i neuroner er fordelagtigt til belysning af patogenesen af neurologiske lidelser. Imidlertid gør den lille størrelse af neuroner og det tætte arrangement af aksonale mikrotubulusbundter visualisering af mikrotubulusnetværkene udfordrende. I dette studie beskriver vi en metode til dissektion af larvens neuromuskulære kryds og muskelceller samt immunfarvning af α-tubulin og mikrotubulusassocieret protein Futsch for at visualisere mikrotubulusnetværk i Drosophila melanogaster. Det neuromuskulære kryds tillader os at observere både præ- og postsynaptiske mikrotubuli, og den store størrelse af muskelceller i Drosophila-larven muliggør klar visualisering af mikrotubulusnetværket. Her, ved at mutere og overudtrykke Katanin 60 i Drosophila melanogaster og derefter undersøge mikrotubulusnetværkene i det neuromuskulære kryds og muskelceller, afslører vi nøjagtigt Katanin 60’s regulerende rolle i neuroudvikling. Derfor, kombineret med de kraftfulde genetiske værktøjer af Drosophila melanogaster, letter denne protokol i høj grad genetisk screening og mikrotubulusdynamikanalyse for rollen som mikrotubulusnetværksregulerende proteiner i nervesystemet.

Introduction

Mikrotubuli (MT’er), som en af cytoskeletets strukturelle komponenter, spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer, herunder celledeling, cellevækst og motilitet, intracellulær transport og vedligeholdelse af celleform. Mikrotubulus dynamik og funktion moduleres af interaktioner med andre proteiner, såsom MAP1, MAP2, Tau, Katanin og Kinesin 1,2,3,4,5.

I neuroner er mikrotubuli afgørende for udvikling og vedligeholdelse af axoner og dendritter. Abnormiteter i mikrotubuli fører til dysfunktion og endda neuronernes død. For eksempel reducerer Tau-proteinhyperphosphorylering i hjernen hos Alzheimers patienter stabiliteten af mikrotubulusnetværket og forårsager neurologiske uregelmæssigheder⁶. Således vil undersøgelse af mikrotubulusnetværk bidrage til en forståelse af neuroudvikling og patogenesen af neurologiske sygdomme.

Det neuromuskulære kryds (NMJ) er den perifere synaps dannet mellem en motorneuronaxonterminal og en muskelfiber, som er et fremragende og kraftfuldt modelsystem til undersøgelse af synaptisk struktur og funktioner⁷. Futsch er et protein i Drosophila, der er homologt med det mikrotubulusbindende protein MAP1B, der findes hos pattedyr⁸. Det udtrykkes kun i neuroner og spiller en rolle i udviklingen af NMJ’s synaptiske knapper ^8,9. I vildtype visualiseres filamentøse bundter, der løber langs midten af NMJ-processer, ved immunfarvning med anti-Futsch. Når NMJ’s ende nås, har dette bundt evnen til enten at danne en løkke bestående af mikrotubuli eller at miste sin trådformede struktur, hvilket resulterer i et diffust og punkteret udseende¹⁰. Mikrotubulussløjfer er forbundet med pausede vækstkegler, hvilket tyder på, at mikrotubulusarrayet er stabilt¹¹. Derfor kan vi indirekte bestemme den stabile mikrotubulusudvikling i NMJ ved Futsch-farvning. Den store størrelse af muskelceller i Drosophila larve giver mulighed for klar visualisering af mikrotubulusnetværket. De faktorer, der påvirker stabiliteten af mikrotubulusnetværket, kan findes ved at analysere tætheden og formen af mikrotubuli. Samtidig kan muskelcellernes mikrotubulusnetværksstatus krydsverificeres med resultatet af NMJ for at opnå mere omfattende konklusioner.

Mange protokoller er blevet anvendt til at undersøge mikrotubulis netværk og dynamik. Imidlertid har disse undersøgelser ofte fokuseret på in vitro-undersøgelser 12,13,14,15,16. Alternativt har nogle in vivo-eksperimenter anvendt elektronmikroskopi til at detektere cytoskelettet¹⁷. Ifølge den specifikke binding af fluorescerende mærkede antistoffer eller kemiske farvestoffer til proteiner eller DNA tillader de metoder, der præsenteres her, påvisning af mikrotubulusnetværk i NMJ på niveauet af individuelle neuroner in vivo, med resultater bekræftet af observationer i muskelceller. Denne protokol er enkel, stabil og gentagelig, når den kombineres med de kraftfulde genetiske værktøjer, der er tilgængelige i Drosophila melanogaster, hvilket muliggør en bred vifte af fænotypiske undersøgelser og genetiske screeninger for rollen som mikrotubulusnetværksregulerende proteiner i nervesystemet in vivo.

Protocol

1. Dissektion af larver BEMÆRK: Den dissekerende opløsning hæmolymfelignende saltvand (HL3.1)18 og fikseringsopløsningen 4% paraformaldehyd (PFA)19,20 anvendes ved stuetemperatur, fordi mikrotubuli depolymeriserer, når temperaturen er for lav. Vælg en vandrende 3. stjernelarve med lange stumpe tang. Vask det med HL3.1 og læg det på dissektionsskålen under stereomikr…

Representative Results

Vi demonstrerede en trin-for-trin procedure til visualisering af mikrotubulusnetværket i både neuromuskulære kryds (NMJ’er) og muskelceller. Efter dissektion i henhold til det skematiske diagram (figur 1A-E) udføres immunfarvning, og billeder observeres efterfølgende og indsamles under et laserkonfokalmikroskop eller et stereoskopisk fluorescensmikroskop (figur 1F, G). Både præ- og postsynaptis…

Discussion

Her beskrives en protokol til dissektion og immunfarvning af Drosophila-larve , neuromuskulære krydsninger og muskelceller. Der er flere vigtige punkter at overveje. For det første er det afgørende at undgå skade på de observerede muskler under dissektionsprocessen. Det kan være værd at fastgøre fileten, før du fjerner indre organer for at forhindre direkte kontakt mellem tang og muskler. For at undgå muskelskader eller adskillelse fra larveepidermis er det vigtigt at sikre, at rysterens hastighed ikke…

Materials

Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342