Summary

Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli

Published: October 20, 2023
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Summary

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l’analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Abstract

La rete di microtubuli è una componente essenziale del sistema nervoso. Le mutazioni in molte proteine regolatorie dei microtubuli sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurologiche, come la proteina Tau associata ai microtubuli per le malattie neurodegenerative, la proteina di recisione dei microtubuli Spastin e Katanin 60 causano rispettivamente paraplegia spastica ereditaria e anomalie dello sviluppo neurologico. Il rilevamento di reti di microtubuli nei neuroni è vantaggioso per chiarire la patogenesi dei disturbi neurologici. Tuttavia, le piccole dimensioni dei neuroni e la disposizione densa dei fasci di microtubuli assonali rendono difficile la visualizzazione delle reti di microtubuli. In questo studio, descriviamo un metodo per la dissezione della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari, nonché l’immunocolorazione della α-tubulina e della proteina Futsch associata ai microtubuli per visualizzare le reti di microtubuli in Drosophila melanogaster. La giunzione neuromuscolare ci permette di osservare sia i microtubuli pre che post-sinaptici, e le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. Qui, mutando e sovraesprimendo la Katanina 60 in Drosophila melanogaster, e quindi esaminando le reti di microtubuli nella giunzione neuromuscolare e nelle cellule muscolari, riveliamo accuratamente il ruolo regolatore della Katanina 60 nel neurosviluppo. Pertanto, combinato con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l’analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.

Introduction

I microtubuli (MT), come uno dei componenti strutturali del citoscheletro, svolgono un ruolo importante in diversi processi biologici, tra cui la divisione cellulare, la crescita e la motilità cellulare, il trasporto intracellulare e il mantenimento della forma cellulare. La dinamica e la funzione dei microtubuli sono modulate dalle interazioni con altre proteine, come MAP1, MAP2, Tau, Katanina e Kinesina 1,2,3,4,5.

Nei neuroni, i microtubuli sono essenziali per lo sviluppo e il mantenimento di assoni e dendriti. Le anomalie nei microtubuli portano a disfunzioni e persino alla morte dei neuroni. Ad esempio, nel cervello dei malati di Alzheimer, l’iperfosforilazione della proteina Tau riduce la stabilità della rete di microtubuli, causando irregolarità neurologiche6. Pertanto, l’esame delle reti di microtubuli contribuirà alla comprensione del neurosviluppo e della patogenesi delle malattie neurologiche.

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica formata tra un terminale dell’assone del motoneurone e una fibra muscolare, che è un eccellente e potente sistema modello per lo studio della struttura e delle funzioni sinaptiche7. Futsch è una proteina della Drosophila omologa alla proteina legante i microtubuli MAP1B presente nei mammiferi8. È espresso solo nei neuroni e svolge un ruolo nello sviluppo dei pulsanti sinaptici del NMJ 8,9. Nel wild-type, i fasci filamentosi che corrono lungo il centro dei processi NMJ sono visualizzati mediante immunocolorazione con anti-Futsch. Quando raggiunge l’estremità di NMJ, questo fascio ha la capacità di formare un anello costituito da microtubuli o di perdere la sua struttura filamentosa, risultando in un aspetto diffuso e punteggiato10. Le anse dei microtubuli sono associate a coni di crescita in pausa, il che suggerisce che l’array di microtubuli è stabile11. Pertanto, possiamo determinare indirettamente lo sviluppo stabile dei microtubuli nella NMJ mediante colorazione Futsch. Le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. I fattori che influenzano la stabilità della rete di microtubuli possono essere trovati analizzando la densità e la forma dei microtubuli. Allo stesso tempo, lo stato della rete di microtubuli delle cellule muscolari può essere verificato in modo incrociato con il risultato della NMJ per ottenere conclusioni più complete.

Molti protocolli sono stati impiegati per studiare la rete e la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, queste ricerche si sono spesso concentrate su studi in vitro 12,13,14,15,16. In alternativa, alcuni esperimenti in vivo hanno impiegato la microscopia elettronica per rilevare il citoscheletro17. In base al legame specifico di anticorpi marcati con fluorescenza o coloranti chimici a proteine o DNA, i metodi qui presentati consentono di rilevare reti di microtubuli nella NMJ a livello di singoli neuroni in vivo, con risultati corroborati da osservazioni in cellule muscolari. Questo protocollo è semplice, stabile e ripetibile se combinato con i potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila melanogaster, consentendo una vasta gamma di esami fenotipici e screening genetici per il ruolo delle proteine regolatorie della rete di microtubuli nel sistema nervoso in vivo.

Protocol

1. Dissezione delle larve NOTA: La soluzione salina emolinfa-simile (HL3.1)18 e la soluzione fissante paraformaldeide al 4% (PFA)19,20 vengono utilizzate a temperatura ambiente perché i microtubuli depolimerizzano quando la temperatura è troppo bassa. Scegli una larva vagante di 3° stadio con una lunga pinza smussata. Lavarlo con HL3.1 e posizionarlo sul piatto di dissezi…

Representative Results

Abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per visualizzare la rete di microtubuli sia nelle giunzioni neuromuscolari (NMJ) che nelle cellule muscolari. Dopo la dissezione secondo il diagramma schematico (Figura 1A-E), viene eseguita l’immunocolorazione e le immagini vengono successivamente osservate e raccolte con un microscopio confocale laser o un microscopio stereoscopico a fluorescenza (Figura 1F,G). <p class="jove_co…

Discussion

Qui viene descritto un protocollo per la dissezione e l’immunocolorazione delle giunzioni neuromuscolari larvali e delle cellule muscolari della Drosophila . Ci sono diversi punti essenziali da considerare. In primo luogo, evitare lesioni ai muscoli osservati è fondamentale durante il processo di dissezione. Potrebbe valere la pena fissare il filetto prima di rimuovere gli organi interni per evitare il contatto diretto tra le pinze e i muscoli. Per evitare danni muscolari o la separazione dall’epidermide larval…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Ying Xiong per le discussioni e i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione della National Science Foundation of China (NSFC) a C. M. (31500839).

Materials

Alexa Fluor Plus 405 phalloidin invitrogen A30104 dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium Beyotime P0128M
FV10-ASW confocal microscope Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated Thermo Fisher A-11001 dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710 Zeiss
Micro Scissors 66vision 54138B
Mouse anti-Futsch antibody Developmental Studies Hybridoma Bank   22C10 dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody Sigma T5168 dilute 1:1,000
Paraformaldehyde Wako 168-20955 Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins Entomoravia 0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161 Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41 Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP Jackson ImmunoResearch dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide Invitrogen T3605 dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8 Kylin-Bell lab instruments E0018
TritonX-100 BioFroxx 1139
Tweezers  dumont 500342

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).

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Cite This Article
Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin, S., Mao, C. Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network. J. Vis. Exp. (200), e65774, doi:10.3791/65774 (2023).

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