여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미세소관 네트워크는 신경계의 필수 구성 요소입니다. 많은 미세소관 조절 단백질의 돌연변이는 신경퇴행성 질환에 대한 미세소관 관련 단백질 타우(Tau), 미세소관 절단 단백질 스파스틴(Spastin) 및 카타닌 60(Katanin 60)과 같은 신경 발달 장애 및 신경 발달 질환과 관련이 있습니다. 뉴런에서 미세소관 네트워크를 검출하는 것은 신경 장애의 발병 기전을 밝히는 데 유리합니다. 그러나 뉴런의 크기가 작고 축삭 미세소관 다발이 조밀하게 배열되어 있어 미세소관 네트워크를 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 연구에서는 유충 신경근 접합부와 근육 세포의 해부 방법과 α-튜불린 및 미세소관 관련 단백질 Futsch의 면역염색을 통해 Drosophila melanogaster의 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을 설명합니다. 신경근 접합부는 시냅스 전후 미세소관을 모두 관찰할 수 있게 해주며, 초파리 유충의 근육 세포는 크기가 커서 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 카타닌 60을 돌연변이시키고 과발현시킨 다음 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 조사하여 신경 발달에서 카타닌 60의 조절 역할을 정확하게 밝힙니다. 그러므로, Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합해, 이 의정서는 매우 신경계에 있는 microtubule 네트워크 통제 단백질의 역할을 위한 유전자 검열 그리고 microtubule 역동성 분석을 촉진합니다.
서론
미세소관(MT)은 세포골격의 구조적 구성 요소 중 하나로서 세포 분열, 세포 성장 및 운동성, 세포 내 수송, 세포 모양 유지 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미세소관의 역학 및 기능은 MAP1, MAP2, Tau, Katanin 및 Kinesin 1,2,3,4,5와 같은 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 조절됩니다.
뉴런에서 미세소관은 축삭돌기와 수상돌기의 발달과 유지에 필수적입니다. 미세소관의 이상은 기능 장애와 심지어 뉴런의 죽음으로 이어집니다. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 뇌에서 타우 단백질 과인산화는 미세소관 네트워크의 안정성을 감소시켜 신경학적 불규칙성을 유발한다6. 따라서 미세소관 네트워크를 검사하는 것은 신경 발달과 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 데 기여할 것입니다.
신경근 접합부(NMJ)는 운동 뉴런 축삭 말단과 근육 섬유....
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프로토콜
1. 유충 해부
알림: 해부 용액 혈림프 유사 식염수(HL3.1)18 및 고정 용액 4% 파라포름알데히드(PFA)19,20은 온도가 너무 낮을 때 미세소관이 해중합되기 때문에 실온에서 사용됩니다.
- 길고 뭉툭한 집게로 방황하는 3번째 인스타 유충을 골라냅니다. HL3.1로 세척하고 실체현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다.
참고: 방황하는 3번째 인스타 유충은 분지된 전방 나선으로 식별되며 약 96시간(25°C)21에서 튜브 주위를 기어 다닙니다. - 등쪽이나 배쪽이 위로 향하도록 유충을 배치합니다. 두 개의 긴 기관으로 등쪽을 식별하고 복부 치아 벨트로 복부를 식별합니다.
- 관찰할 조직에 따라 등쪽 또는 복부 절개를 선택하십시오. 이렇게 하면 특정 관심 영역을 보다 정확하고 자세하게 볼 수 있습니다. NMJ 및 근육 세포 관찰을 위해 유충 등쪽과 복부 부위를 각각 절개합니다.
- 입 고리와 꼬리를 고정합니....
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결과
우리는 신경근 접합부(NMJ)와 근육 세포 모두에서 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 단계별 절차를 시연했습니다. 개략도(그림 1A-E)에 따라 해부한 후 면역염색을 수행하고 레이저 컨포칼 현미경 또는 입체 형광 현미경(그림 1F,G)으로 이미지를 관찰 및 수집합니다.
NMJ의 시냅스 전후 미세소관 조직 모두 항α-튜불린으로 표지할 수 있으며, 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 층 두께를 선택하여 다양한 절편의 미세소관 형태를 표시할 수 있습니다(그림 2A-C). Futsch는 또한 뉴런의 축삭에 있는 미세소관 조직을 밝혀 신경 추적에 사용되었습니다. Anti-HRP는 신경 세포막 10,23,24를 표시하는 데 사용됩니다.
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토론
여기에서는 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포의 해부 및 면역염색을 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 필수 사항이 있습니다. 첫째, 관찰된 근육의 부상을 피하는 것은 해부 과정에서 매우 중요합니다. 집게와 근육 사이의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 내부 장기를 제거하기 전에 필렛을 고정하는 것이 좋습니다. 근육 손상이나 유충 표피로부터의 분리를 방지하려면 세척 및 배양 중에 셰이커의 속도가 15rpm을 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한 NMJ 형태를 선명하고 완벽하게 촬영하기 위해서는 피부 확장에 대한 정밀한 제어가 필요합니다. 항체 농도, 고정, 차단 및 배양 시간을 최적화하기 위해 예비 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 고정 시간은 약 40분으로 제한됩니다. 너무 짧거나 너무 길면 미세소관 네트워크의 면역염색에 도움이 되지 않습니다.
뉴런의 미세소관은 조밀하게 밀집되어 있어 기존 현미경으로 명확하게 시각화하기 어렵습니다. .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
원고에 대한 토론과 논평을 해주신 Ying Xiong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립과학재단(NSFC)이 C. M.(31500839)에 제공한 보조금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | 희석 1:200 |
| 향상된 퇴색 방지 장착 매체 | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW 컨포칼 현미경 | Olympus | ||
| Goat 안티 마우스 항체, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | 희석 1:1,000 |
| 레이저 컨포칼 현미경 LSM 710 | Zeiss | ||
| 마이크로 가위 | 66vision | 54138B | |
| 마우스 안티-Futsch 항체 | 발달 연구 Hybridoma Bank | 22C10 | 묽게 된 1:50 |
| 마우스 안티-&알파;-튜불린 항체 | Sigma | T5168 | 묽은 1:1,000 |
| 파라포름알데히드 | Wako | 168-20955 | 최종 농도: PB 완충액 |
| 스테인리스강 Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| 입체 형광 현미경 BX41 | 올림푸스 | ||
| 텍사스 레드-콘공이티드 염소 안티-HRP | 잭슨 면역 연구 | 희석 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 요오드 | 인비트로젠 | T3605 | 희석 1:1,000 |
| 전사 탈색 쉐이커 TS-8 | Kylin-Bell 실험실 기기 | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| 핀셋 | 듀몽 | 500342 |
참고문헌
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its ....
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