Summary

Bruke Drosophila larver nevromuskulære veikryss og muskelceller for å visualisere mikrotubuli nettverk

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å visualisere mikrotubuli-nettverkene i nevromuskulære veikryss og muskelceller. Kombinert med de kraftige genetiske verktøyene til Drosophila melanogaster, letter denne protokollen i stor grad genetisk screening og mikrotubuli-dynamikkanalyse for rollen som mikrotubulinettverksregulerende proteiner i nervesystemet.

Abstract

Mikrotubulinettverket er en viktig komponent i nervesystemet. Mutasjoner i mange mikrotubuli regulatoriske proteiner er assosiert med nevrodevelopmental lidelser og nevrologiske sykdommer, slik som mikrotubuli-assosiert protein Tau til neurodegenerative sykdommer, mikrotubuli kutte protein Spastin og Katanin 60 forårsake arvelig spastisk paraplegi og nevrodevelopmental abnormiteter, henholdsvis. Deteksjon av mikrotubulære nettverk i nevroner er fordelaktig for å belyse patogenesen av nevrologiske lidelser. Den lille størrelsen på nevroner og det tette arrangementet av aksonale mikrotubulibunter gjør imidlertid visualisering av mikrotubuli-nettverkene utfordrende. I denne studien beskriver vi en metode for disseksjon av larvens nevromuskulære overgang og muskelceller, samt immunfarging av α-tubulin og mikrotubuli-assosiert protein Futsch for å visualisere mikrotubulinettverk i Drosophila melanogaster. Det nevromuskulære veikrysset tillater oss å observere både pre- og postsynaptiske mikrotubuli, og den store størrelsen på muskelceller i Drosophila-larven muliggjør klar visualisering av mikrotubulinettverket. Her, ved å mutere og overuttrykke Katanin 60 i Drosophila melanogaster, og deretter undersøke mikrotubuli-nettverkene i det nevromuskulære veikrysset og muskelcellene, avslører vi nøyaktig den regulatoriske rollen til Katanin 60 i nevroutvikling. Derfor, kombinert med de kraftige genetiske verktøyene til Drosophila melanogaster, letter denne protokollen i stor grad genetisk screening og mikrotubuli dynamikkanalyse for rollen som mikrotubuli nettverksregulerende proteiner i nervesystemet.

Introduction

Mikrotubuli (MT), som en av de strukturelle komponentene i cytoskelettet, spiller en viktig rolle i ulike biologiske prosesser, inkludert celledeling, cellevekst og motilitet, intracellulær transport og vedlikehold av celleform. Mikrotubuli dynamikk og funksjon moduleres av interaksjoner med andre proteiner, slik som MAP1, MAP2, Tau, Katanin og Kinesin 1,2,3,4,5.

I nevroner er mikrotubuli avgjørende for utvikling og vedlikehold av aksoner og dendritter. Abnormaliteter i mikrotubuli fører til dysfunksjon og til og med død av nevroner. For eksempel, i hjernen til Alzheimers pasienter, reduserer Tau-protein hyperfosforylering stabiliteten til mikrotubulinettverket, noe som forårsaker nevrologiske uregelmessigheter6. Dermed vil undersøkelse av mikrotubulinettverk bidra til en forståelse av nevroutvikling og patogenesen av nevrologiske sykdommer.

Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er den perifere synapsen dannet mellom en motorneuronaksonterminal og en muskelfiber, som er et utmerket og kraftig modellsystem for å studere synaptisk struktur og funksjoner7. Futsch er et protein i Drosophila som er homologt med det mikrotubulibindende proteinet MAP1B som finnes hos pattedyr8. Det uttrykkes bare i nevroner og spiller en rolle i utviklingen av NMJs synaptiske knapper 8,9. I villtype visualiseres filamentøse bunter som går langs midten av NMJ-prosesser ved immunfarging med anti-Futsch. Når den når NMJs ende, har denne bunten evnen til enten å danne en sløyfe bestående av mikrotubuli eller å miste sin trådformede struktur, noe som resulterer i et diffust og punktert utseende10. Mikrotubuli sløyfer er assosiert med pauset vekstkjegler, noe som antyder at mikrotubuli-matrisen er stabil11. Derfor kan vi indirekte bestemme den stabile mikrotubuliutviklingen i NMJ ved Futsch-farging. Den store størrelsen på muskelceller i Drosophila larven muliggjør klar visualisering av mikrotubulinettverket. Faktorene som påvirker stabiliteten til mikrotubuli-nettverket kan bli funnet ved å analysere tettheten og formen til mikrotubuli. Samtidig kan mikrotubuli nettverksstatus for muskelceller kryssverifiseres med resultatet av NMJ for å oppnå mer omfattende konklusjoner.

Mange protokoller har blitt brukt for å undersøke nettverket og dynamikken til mikrotubuli. Imidlertid har disse undersøkelsene ofte fokusert på in vitro-studier 12,13,14,15,16. Alternativt har noen in vivo-eksperimenter brukt elektronmikroskopi for å oppdage cytoskjelettet17. I henhold til den spesifikke bindingen av fluorescerende merkede antistoffer eller kjemiske fargestoffer til proteiner eller DNA, tillater metodene som presenteres her deteksjon av mikrotubulinettverk i NMJ på nivået av individuelle nevroner in vivo, med resultater bekreftet av observasjoner i muskelceller. Denne protokollen er enkel, stabil og repeterbar når den kombineres med de kraftige genetiske verktøyene som er tilgjengelige i Drosophila melanogaster, noe som muliggjør et mangfoldig utvalg av fenotypiske undersøkelser og genetiske screeninger for rollen som mikrotubulinettverksregulatoriske proteiner i nervesystemet in vivo.

Protocol

1. Disseksjon av larver MERK: Dissekeringsløsningen hemolymfelignende saltvann (HL3.1)18 og fikseringsløsningen 4% paraformaldehyd (PFA)19,20 brukes ved romtemperatur fordi mikrotubuli depolymeriseres når temperaturen er for lav. Plukk ut envandrende 3 rd instar larve med lang, butt tang. Vask den med HL3.1 og legg den på disseksjonsfatet under stereomikroskopet.MERK…

Representative Results

Vi demonstrerte en trinnvis prosedyre for visualisering av mikrotubulinettverket i både nevromuskulære veikryss (NMJ) og muskelceller. Etter disseksjon i henhold til skjematisk diagram (figur 1A-E) utføres immunfarging, og bilder observeres og samles deretter under et laserkonfokalmikroskop eller et stereoskopisk fluorescensmikroskop (figur 1F,G). Både pre- og postsynaptisk mikrotubuli organiserin…

Discussion

Her beskrives en protokoll for disseksjon og immunfarging av Drosophila larve, nevromuskulære veikryss og muskelceller. Det er flere viktige punkter å vurdere. For det første er det viktig å unngå skade på de observerte musklene under disseksjonsprosessen. Det kan være verdt å feste fileten før du fjerner indre organer for å hindre direkte kontakt mellom tangen og musklene. For å unngå muskelskade eller separasjon fra larveepidermis, er det viktig å sikre at shakerens hastighet ikke overstiger 15 o …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Ying Xiong for diskusjoner og kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet støttes av et tilskudd fra National Science Foundation of China (NSFC) til CM (31500839).

Materials

Alexa Fluor Plus 405 phalloidin invitrogen A30104 dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium Beyotime P0128M
FV10-ASW confocal microscope Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated Thermo Fisher A-11001 dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710 Zeiss
Micro Scissors 66vision 54138B
Mouse anti-Futsch antibody Developmental Studies Hybridoma Bank   22C10 dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody Sigma T5168 dilute 1:1,000
Paraformaldehyde Wako 168-20955 Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins Entomoravia 0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161 Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41 Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP Jackson ImmunoResearch dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide Invitrogen T3605 dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8 Kylin-Bell lab instruments E0018
TritonX-100 BioFroxx 1139
Tweezers  dumont 500342

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
  3. Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
  4. Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
  5. Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
  6. Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
  7. Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
  8. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
  9. Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
  10. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
  12. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
  13. Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
  14. Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
  15. Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
  16. Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
  17. Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
  18. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
  19. Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
  20. Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
  21. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
  22. Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
  23. Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
  24. Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
  25. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  26. Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
  27. Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
check_url/65774?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin, S., Mao, C. Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network. J. Vis. Exp. (200), e65774, doi:10.3791/65774 (2023).

View Video