Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att visualisera mikrotubulinätverken i neuromuskulära korsningar och muskelceller. I kombination med de kraftfulla genetiska verktygen hos Drosophila melanogaster, underlättar detta protokoll i hög grad genetisk screening och mikrotubulidynamisk analys för rollen som mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet.
Mikrotubulinätverket är en viktig komponent i nervsystemet. Mutationer i många mikrotubuliregulatoriska proteiner är associerade med utvecklingsneurologiska funktionsnedsättningar och neurologiska sjukdomar, såsom mikrotubuli-associerat protein Tau till neurodegenerativa sjukdomar, mikrotubuliavskiljande protein Spastin och Katanin 60 orsakar ärftlig spastisk paraplegi respektive utvecklingsneurologiska avvikelser. Detektion av mikrotubulinätverk i nervceller är fördelaktigt för att belysa patogenesen av neurologiska sjukdomar. Den lilla storleken på neuroner och det täta arrangemanget av axonala mikrotubulibuntar gör det dock utmanande att visualisera mikrotubulinätverken. I denna studie beskriver vi en metod för dissektion av larvneuromuskulära förbindelser och muskelceller, samt immunfärgning av α-tubulin och mikrotubuli-associerat protein Futsch för att visualisera mikrotubulinätverk i Drosophila melanogaster. Den neuromuskulära förbindelsen gör det möjligt för oss att observera både pre- och postsynaptiska mikrotubuli, och den stora storleken på muskelcellerna i Drosophila-larven möjliggör tydlig visualisering av mikrotubulinätverket. Här, genom att mutera och överuttrycka Katanin 60 i Drosophila melanogaster, och sedan undersöka mikrotubulinätverken i den neuromuskulära förbindelsen och muskelcellerna, avslöjar vi exakt den reglerande rollen för Katanin 60 i neuroutveckling. Därför, i kombination med de kraftfulla genetiska verktygen hos Drosophila melanogaster, underlättar detta protokoll i hög grad genetisk screening och analys av mikrotubulidynamik för rollen som mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet.
Mikrotubuli (MT), som en av de strukturella komponenterna i cytoskelettet, spelar en viktig roll i olika biologiska processer, inklusive celldelning, celltillväxt och motilitet, intracellulär transport och underhåll av cellform. Mikrotubulidynamik och funktion moduleras av interaktioner med andra proteiner, såsom MAP1, MAP2, Tau, Katanin och Kinesin 1,2,3,4,5.
I neuroner är mikrotubuli viktiga för utveckling och underhåll av axoner och dendriter. Avvikelser i mikrotubuli leder till dysfunktion och till och med neuronerdöd. Till exempel, i hjärnan hos Alzheimerspatienter, minskar Tau-proteinhyperfosforylering stabiliteten i mikrotubulinätverket, vilket orsakar neurologiska oregelbundenheter6. Således kommer undersökning av mikrotubulinätverk att bidra till en förståelse av neuroutveckling och patogenesen av neurologiska sjukdomar.
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är den perifera synapsen som bildas mellan en motorneuronaxonterminal och en muskelfiber, vilket är ett utmärkt och kraftfullt modellsystem för att studera synaptisk struktur och funktioner7. Futsch är ett protein i Drosophila som är homologt med det mikrotubulibindande proteinet MAP1B som finns hosdäggdjur8. Det uttrycks endast i neuroner och spelar en roll i utvecklingen av NMJ:s synaptiska knappar 8,9. I vildtyp visualiseras filamentösa buntar som löper längs mitten av NMJ-processer genom immunfärgning med anti-Futsch. När den når NMJ:s ände har denna bunt förmågan att antingen bilda en slinga bestående av mikrotubuli eller förlora sin trådformiga struktur, vilket resulterar i ett diffust och punkterat utseende10. Mikrotubulislingor är associerade med pausade tillväxtkoner, vilket tyder på att mikrotubulimatrisen är stabil11. Därför kan vi indirekt bestämma den stabila mikrotubuliutvecklingen i NMJ genom Futsch-färgning. Den stora storleken på muskelcellerna i Drosophila-larven möjliggör en tydlig visualisering av mikrotubulinätverket. De faktorer som påverkar stabiliteten i mikrotubulinätverket kan hittas genom att analysera mikrotubulis densitet och form. Samtidigt kan muskelcellernas mikrotubulinätverksstatus korsverifieras med resultatet av NMJ för att få mer omfattande slutsatser.
Många protokoll har använts för att undersöka nätverket och dynamiken hos mikrotubuli. Dessa undersökningar har dock ofta fokuserat på in vitro-studier 12,13,14,15,16. Alternativt har vissa in vivo-experiment använt elektronmikroskopi för att detektera cytoskelettet17. Enligt den specifika bindningen av fluorescerande märkta antikroppar eller kemiska färgämnen till proteiner eller DNA, möjliggör de metoder som presenteras här detektion av mikrotubulinätverk i NMJ på nivån av enskilda neuroner in vivo, med resultat som bekräftas av observationer i muskelceller. Detta protokoll är enkelt, stabilt och repeterbart när det kombineras med de kraftfulla genetiska verktyg som finns tillgängliga i Drosophila melanogaster, vilket möjliggör ett brett spektrum av fenotypiska undersökningar och genetiska screeningar för rollen av mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet in vivo.
Här beskrivs ett protokoll för dissektion och immunfärgning av neuromuskulära neuromuskulära förbindelser och muskelceller hos Drosophila-larver . Det finns flera viktiga punkter att tänka på. För det första är det viktigt att undvika skador på de observerade musklerna under dissektionsprocessen. Det kan vara värt att fixa filén innan man tar bort inre organ för att förhindra direktkontakt mellan pincetten och musklerna. För att undvika muskelskador eller separation från larvepidermis är det v…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Ying Xiong för diskussioner och kommentarer om manuskriptet. Detta arbete stöds av ett anslag från National Science Foundation of China (NSFC) till C. M. (31500839).
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
Tweezers | dumont | 500342 |