Presentert er en protokoll for high-throughput drug screening for å forbedre søvn ved å overvåke søvnadferden til fruktfluer i en eldre Drosophila-modell .
Søvn, en viktig del av helse og generell velvære, gir ofte utfordringer for eldre personer som ofte opplever søvnforstyrrelser preget av forkortet søvnvarighet og fragmenterte mønstre. Disse søvnforstyrrelsene korrelerer også med økt risiko for ulike sykdommer hos eldre, inkludert diabetes, kardiovaskulære sykdommer og psykiske lidelser. Dessverre er eksisterende medisiner for søvnforstyrrelser forbundet med betydelige bivirkninger som kognitiv svekkelse og avhengighet. Følgelig er det et presserende behov for utvikling av nye, sikrere og mer effektive medisiner for søvnforstyrrelser. Den høye kostnaden og lange eksperimentelle varigheten av dagens narkotikascreeningsmetoder forblir imidlertid begrensende faktorer.
Denne protokollen beskriver en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømningsscreeningsmetode som bruker Drosophila melanogaster, en art med en svært konservert søvnreguleringsmekanisme sammenlignet med pattedyr, noe som gjør den til en ideell modell for å studere søvnforstyrrelser hos eldre. Ved å administrere ulike små forbindelser til eldre fluer, kan vi vurdere deres effekter på søvnforstyrrelser. Søvnatferden til disse fluene registreres ved hjelp av en infrarød overvåkingsenhet og analyseres med åpen kildekode-datapakken Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Denne protokollen tilbyr en rimelig, reproduserbar og effektiv screeningtilnærming for søvnregulering. Bananfluer, på grunn av deres korte livssyklus, lave oppdrettskostnader og enkle håndtering, tjener som gode emner for denne metoden. Som en illustrasjon demonstrerte Reserpine, et av de testede legemidlene, evnen til å fremme søvnvarighet hos eldre fluer, og fremhevet effektiviteten av denne protokollen.
Søvn, en av de essensielle atferdene som er nødvendige for menneskelig overlevelse, er preget av to hovedtilstander: rask øyebevegelse (REM) søvn og ikke-rask øyebevegelse (NREM) søvn1. NREM-søvn består av tre stadier: N1 (overgangen mellom våkenhet og søvn), N2 (lett søvn) og N3 (dyp søvn, langsom bølgesøvn), som representerer progresjonen fra våkenhet til dyp søvn1. Søvn spiller en avgjørende rolle for både fysisk og psykisk helse2. Aldring reduserer imidlertid total søvnvarighet, søvneffektivitet, søvnprosent med langsomme bølger og REM-søvnprosent hos voksne3. Eldre individer har en tendens til å bruke mer tid i lett søvn sammenlignet med langsom bølgesøvn, noe som gjør dem mer følsomme for nattlige oppvåkninger. Etter hvert som antall oppvåkninger øker, reduseres gjennomsnittlig søvntid, noe som resulterer i et fragmentert søvnmønster hos eldre, noe som kan være forbundet med overdreven eksitering av Hcrt-nevroner hos mus4. I tillegg bidrar aldersrelaterte reduksjoner i sirkadiske mekanismer til et tidligere skifte i søvnvarighet 5,6. I kombinasjon med fysisk sykdom, psykisk stress, miljøfaktorer og medisinbruk, gjør disse faktorene eldre voksne mer utsatt for søvnforstyrrelser, som søvnløshet, REM-søvnadferdsforstyrrelse, narkolepsi, periodiske benbevegelser, rastløse bensyndrom og søvnforstyrret pust 7,8.
Epidemiologiske studier har vist at søvnforstyrrelser er nært knyttet til kroniske sykdommer hos eldre9, inkludert depresjon10, kardiovaskulær sykdom 11 og demens12. Å adressere søvnforstyrrelser spiller en avgjørende rolle i å forbedre og behandle kroniske sykdommer og forbedre livskvaliteten for eldre voksne. For tiden er pasienter primært avhengige av medisiner som benzodiazepiner, ikke-benzodiazepiner og melatoninreseptoragonister for å forbedre søvnkvaliteten13. Benzodiazepiner kan imidlertid føre til nedregulering av reseptorer og avhengighet etter langvarig bruk, og forårsake alvorlige abstinenssymptomer ved seponering14,15. Ikke-benzodiazepinmedikamenter bærer også risiko, inkludert demens 16, brudd17 og kreft18. Den vanlige melatoninreseptoragonisten, ramelteon, reduserer søvnforsinkelsen, men øker ikke søvnvarigheten og har leverfunksjonsrelaterte bekymringer på grunn av omfattende førstepassasjeeliminering19. Agomelatin, en melatoninreseptoragonist og serotoninreseptorantagonist, forbedrer depresjonsrelatert søvnløshet, men utgjør også en risiko for leverskade20. Følgelig er det et presserende behov for sikrere medisiner for å behandle eller lindre søvnforstyrrelser. Imidlertid er nåværende narkotikascreeningsstrategier, basert på molekylære og cellulære eksperimenter kombinert med automatiserte systemer og dataanalyse, dyre og tidkrevende21. Strukturbaserte legemiddeldesignstrategier, avhengig av reseptorstruktur og egenskaper, krever en klar forståelse av reseptorens tredimensjonale struktur og mangler prediktive evner for legemiddeleffekter22.
I 2000, basert på søvnkriteriene foreslått av Campbell og Tobler i 1984 23, etablerte forskere enkle dyremodeller for å studere søvn 24, inkludert Drosophila melanogaster, som viste søvnlignende tilstander25,26. Til tross for anatomiske forskjeller mellom Drosophila og mennesker, er mange nevrokjemiske komponenter og signalveier som regulerer søvn i Drosophila bevart i pattedyrs søvn, noe som letter studiet av menneskelige nevrologiske sykdommer27,28. Drosophila er også mye brukt i sirkadiske rytmestudier, til tross for forskjeller i kjerneoscillatorer mellom fluer og pattedyr 29,30,31. Derfor tjener Drosophila som en verdifull modellorganisme for å studere søvnadferd og gjennomføre søvnrelatert legemiddelscreening.
Denne studien foreslår en kostnadseffektiv og enkel fenotypebasert tilnærming for screening av småmolekylære legemidler for å behandle søvnforstyrrelser ved bruk av eldre fluer. Søvnregulering i Drosophila er svært bevart25, og nedgangen i søvn observert med alderen kan være reversibel gjennom legemiddeladministrasjon. Dermed kan denne søvnfenotypebaserte screeningsmetoden intuitivt gjenspeile legemiddeleffekten. Vi mater fluene med en blanding av stoffet som undersøkes og mat, overvåker og registrerer søvnadferd ved hjelp av Drosophila Activity Monitor (DAM) 32, og analyserer de oppkjøpte dataene ved hjelp av åpen kildekode-SCAMP2020 datapakke i MATLAB (figur 1). Statistisk analyse utføres ved hjelp av statistikk og grafisk programvare (se Materialfortegnelse). Som et eksempel demonstrerer vi effektiviteten av denne protokollen ved å presentere eksperimentelle data på Reserpine, en liten molekylinhibitor av vesikulær monoamintransportør rapportert å øke søvn33. Denne protokollen gir en verdifull tilnærming til å identifisere legemidler for behandling av aldersrelaterte søvnproblemer.
Den beskrevne metoden er egnet for rask screening av små og mellomstore søvnmedisiner. For tiden er de fleste vanlige screeningsmetoder med høy gjennomstrømning basert på biokjemiske og cellulære nivåer. For eksempel undersøkes strukturen og egenskapene til reseptoren for å søke etter spesifikke ligander som kan binde seg til den22. En annen tilnærming innebærer å analysere bindingsmodus og styrke av molekylære fragmenter av utvalgte stoffer ved bruk av kjernemagnetisk resonans (NMR)…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker professor Junhai Hans laboratoriemedlemmer for deres diskusjon og kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China 32170970 til YT og “Cyanine Blue Project” av Jiangsu-provinsen til Z.C.Z.
Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
Artificial Climate Box | PRANDT | PRX-1000A | official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
DAM2 Drosophila Activity Monitor | TriKineics | DAM2 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
DAM2system | TriKineics | version:v3.03 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
DAMFileScan | TriKineics | version:1.0.7.0 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
Dimethyl Sulfoxide | SIGMA | 276855 | |
Drosophila Activity Monitoring Incubator | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
Drosophila Bottles | Biologix | 51-17720 | official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
Drosophila: w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC_3605 | |
Excel | Microsoft | version:Excel 2016 | official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
Glass tubes | TriKinetics | PPT5x65 | official website:https://www.trikinetics.com/ |
MATLABR2022b | MathWorks | version:9.13.0.2049777 | official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
Prism | GraphPad | Version:Prism 8.0.1 | official website:https://www.graphpad.com/features |
Reserpine | MACKLIN | R817202-1g | |
Saccharose | SIGMA | 1245GR500 | |
SCAMP | Vecsey Lab | N/A | official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |