Summary

En omfattende tilnærming for å analysere cellekomponentene i cerebrale blodpropper

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Denne studien beskriver en rask og effektiv metode for cellekomponentanalyse av cerebrale blodpropper gjennom blodproppoppløsning, cellefarging og rutinemessig blodundersøkelse.

Abstract

Cerebral trombose, en blodpropp i en cerebral arterie eller vene, er den vanligste typen hjerneinfarkt. Studien av cellekomponentene i cerebral blodpropp er viktig for diagnose, behandling og prognose. Imidlertid er de nåværende tilnærmingene til å studere cellekomponentene i blodproppene hovedsakelig basert på in situ-farging , noe som er uegnet for omfattende studier av cellekomponentene fordi cellene er tett pakket inn i blodproppene. Tidligere studier har vellykket isolert et fibrinolytisk enzym (sFE) fra Sipunculus nudus, som kan nedbryte den tverrbundne fibrin direkte og frigjøre cellekomponentene. Denne studien etablerte en omfattende metode basert på sFE for å studere cellekomponentene i cerebral trombus. Denne protokollen inkluderer blodproppoppløsning, cellefrigjøring, cellefarging og rutinemessig blodundersøkelse. Ifølge denne metoden kunne cellekomponentene studeres kvantitativt og kvalitativt. De representative resultatene av eksperimenter ved hjelp av denne metoden er vist.

Introduction

Cerebrovaskulær sykdom er en av tre store sykdommer som kan true menneskers helse, blant annet iskemisk cerebrovaskulær sykdom står for mer enn 80%. Cerebral trombose og cerebral venetrombose er de mest bekymrede iskemiske cerebrovaskulære sykdommene i dag, hovedsakelig forårsaket av cerebrale blodpropper 1,2. Dersom behandlingen ikke gjøres riktig, vil den ha høy invaliditets- og dødelighet og høyt tilbakefall etter utskrivning3.

Nylig har et økende antall studier vist at cellekomponentene i cerebral blodpropp er tett korrelert med diagnosen, behandlingen og prognosen av cerebral trombose 4,5,6. Derfor er tilgjengeligheten av data om trombussammensetning, spesielt cellekomponentene, viktig for klinisk diagnose og behandling. Dessverre kan de tilgjengelige metodene ikke analysere blodproppkomponenten kvantitativt og kvalitativt. For eksempel kan Martius Scarlett Blue-basert in situ-farging bare studere de røde / hvite blodcellene i visse skiver av blodproppen7. Immunhistokjemi (IHC) basert in situ farging kan bare studere begrensede blodkomponenter av visse skiver av blodproppen ved hjelp av antistoffene8. De mikroskopiske bildebaserte metodene er bare opptatt av den spesifikke strukturen til blodproppen9. Dessuten er alle disse metodene arbeidskrevende og tidkrevende10. Hittil har prosedyrene for kvantitativt og kvalitativt studier av cerebrale trombiske cellekomponenter ikke blitt rapportert. Det er allment anerkjent at den tverrbundne fibrin tett pakker blodcellene i blodproppene11. Følgelig er den spesifikke nedbrytningen av det tverrbundne fibrin og frigjøring av de intakte cellene kritisk for nøyaktig analyse av cellekomponenter.

Tidligere arbeider isolerte et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus (sFE), som kan nedbryte fibrin spesifikt og raskt12. Her ble det foreslått en metode for å analysere cellekomponentene i hjernetrombi basert på den unike aktiviteten til sFE. Denne protokollen benyttet sFE til å nedbryte fibrin av blodpropper først og deretter analysert cellekomponentene ved Wrights farging og rutinemessig blodundersøkelse13,14. Ifølge denne metoden kan cellekomponentene i cerebral trombi studeres kvantitativt og kvalitativt. Denne enkle og effektive protokollen kan brukes for cellekomponentanalyse av andre blodpropper.

Protocol

Forskningen ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjene fra Medical Ethics Committee of Huaqiao University. De cerebrale blodproppene ble kirurgisk fjernet og samlet inn ved Quanzhou First Hospital, tilknyttet Fujian Medical University, med informert samtykke fra pasientene. 1. Forbehandling av blodpropp Legg blodproppene på et rent fat, tilsett 5 ml fysiologisk saltvann med en pinsett, rist fatet forsiktig og fjern saltvannet med en pipette.MER…

Representative Results

I den første fasen av nedbrytningsprosessen ble det funnet at blodproppene hadde en rød kompakt struktur, og arbeidsløsningen var fargeløs. Etter inkubering i 30 minutter ble arbeidsløsningen lys rød, noe som indikerte at de kryssede blodcellene ble frigjort i arbeidsløsningen. De fleste blodpropper ble oppløst ved forlengelse av inkubasjonstiden til 5 timer, og arbeidsløsningen ble lysrød. Tvert imot var det ingen signifikant endring i den fysiologiske saltvannsgruppen (NC) selv etter 10 timers inkubasjon (<st…

Discussion

sFE er et fibrinolytisk middel som kan nedbryte fibrin direkte og effektivt12,16. Her ble sFE brukt til å nedbryte den tverrbundne fibrin av cerebrale blodpropper, frigjøre de lukkede cellene i blodproppene og analysere cellekomponentene i blodproppene kvalitativt og kvantitativt. Mikroskopidata og rutinemessig blodprøve tydet på at de lukkede cellene ble frigjort fra blodproppene. Videre ble celletyper og strukturer av de frigjorte cellene ikke påvirket sig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble finansiert av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197), og Science and Technology Bureau of Fujian Province (nr. 2019J01070, No.2021Y0027).

Materials

Agglutination Reaction Plate ROTEST RTB-4003
Auto Hematology Analyzer SYSMEX XNB2
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer  SANYO MLS-3750
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp BS-15-M
Clean bench AIRTECH BLB-1600
Constant Temperature Incubator JINGHONG JHS-400
Culture Dish (100 mm) NEST 704001
DHG Series Heating and Drying Oven  SENXIN DGG-9140AD
Electronic Analytical Balance DENVER TP-213
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP SLGP033NK
Micro Refrigerated Centrifuge  Cence H1650-W
Microscope Slides CITOGLAS 01-30253-50
Milli-Q Reference Millipore Z00QSV0CN
Normal Saline CISEN H37022337
Optical Microscope Nikon ECLIPSE E100
Parafilm Bemis PM-996
Phosphate-Buffered Saline Beyotime C0221A
Pipette Tip (1 mL ) Axygene T-1000XT-C
Pipette Tip (200 µL) Axygene T-200XT-C
Pipettor (1 mL) Thermo Fisher Scientific ZY18723
Pipettor (200 µL) Thermo Fisher Scientific ZY20280
Scalpel MARTOR 23111
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell VORTEX KB3
Tweezer Hystic HKQS-180
Wright Staining Solution Beyotime C0135-500ml

References

  1. Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
  2. Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  3. Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
  4. Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
  5. Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  6. Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
  7. Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
  8. Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
  9. Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
  10. Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
  11. C W Francis, a., Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
  12. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , (2019).
  13. Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
  14. Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
  15. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
  16. Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
  17. Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
  18. Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
check_url/65791?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive Approach to Analyze the Cell Components of Cerebral Blood Clots. J. Vis. Exp. (197), e65791, doi:10.3791/65791 (2023).

View Video