पानी के नमूनों और ऊतकों से डायटम डीएनए का निष्कर्षण
Summary
यह लेख एक संशोधित आम डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर डायटम डीएनए निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Abstract
डायटम परीक्षण फोरेंसिक अभ्यास में एक आवश्यक सहायक साधन है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि लाश पानी में डूब गई या नहीं और डूबने वाले स्थान का अनुमान लगाया जा सके। डायटम परीक्षण भी पर्यावरण और प्लवक के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण शोध सामग्री है। डायटम आणविक जीव विज्ञान परीक्षण तकनीक, जो प्राथमिक अनुसंधान वस्तु के रूप में डायटम डीएनए पर केंद्रित है, डायटम परीक्षण की एक नई विधि है। डायटम डीएनए निष्कर्षण डायटम आणविक परीक्षण का आधार है। वर्तमान में, आमतौर पर डायटम डीएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग की जाने वाली किट महंगी हैं, जिससे संबंधित अनुसंधान करने की लागत बढ़ जाती है। हमारी प्रयोगशाला ने सामान्य संपूर्ण रक्त जीनोमिक डीएनए रैपिड निष्कर्षण किट में सुधार किया और एक संतोषजनक डायटम डीएनए निष्कर्षण प्रभाव प्राप्त किया, इस प्रकार संबंधित अनुसंधान के लिए ग्लास मोतियों के आधार पर एक वैकल्पिक किफायती और सस्ती डीएनए निष्कर्षण समाधान प्रदान किया। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके निकाले गए डायटम डीएनए पीसीआर और अनुक्रमण जैसे कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को संतुष्ट कर सकते हैं।
Introduction
फोरेंसिक अभ्यास में, यह निर्धारित करना कि क्या पानी में पाई गई लाश डूबती है या मृत्यु के बाद पानी में फेंक दी जाती है, मामले के उचित समाधान के लिए आवश्यक है1. यह उन कठिन मुद्दों में से एक है जिन्हें फोरेंसिक अभ्यास2 में तत्काल हल करने की आवश्यकता है। डायटम प्राकृतिक वातावरण (विशेष रूप से पानी में)3,4में प्रचुर मात्रा में हैं। डूबने की प्रक्रिया में, हाइपोक्सिया और तनाव प्रतिक्रिया के कारण, लोगों को तीव्र श्वास आंदोलन होंगे और बड़ी मात्रा में डूबने वाले तरल को श्वास लेंगे। इसलिए, पानी में डायटम डूबने वाले तरल के साथ फेफड़ों में प्रवेश करते हैं, और कुछ डायटम वायुकोशीय केशिका बाधा के माध्यम से रक्त परिसंचरण में प्रवेश कर सकते हैं और रक्त प्रवाह 5,6 के साथ आंतरिक अंगों में फैल सकते हैं। इस तरह के फेफड़े, यकृत, और अस्थि मज्जा के रूप में आंतरिक ऊतकों और अंगों में diatoms का पता लगाने 7,8 मौत से पहले डूबने का एक मजबूत सबूत है. वर्तमान में, फोरेंसिक डायटम परीक्षण मुख्य रूप से रूपात्मक परीक्षण विधियों पर आधारित है। ऊतक के पूर्व-पाचन की एक श्रृंखला के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत अपचित डायटम के रूपात्मक गुणात्मक और मात्रात्मक अनुमान किए जाते हैं। इस अवधि के दौरान, नाइट्रिक एसिड जैसे खतरनाक और पर्यावरण के अनुकूल अभिकर्मकों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया समय लेने वाली है और इसके लिए शोधकर्ताओं को ठोस वर्गीकरण विशेषज्ञता और व्यापक अनुभव की आवश्यकता होती है। ये सभी फोरेंसिक कर्मचारियों के लिए कुछ चुनौतियां लाते हैं9. डायटम डीएनए परीक्षण तकनीक हाल के वर्षों10,11,12 में विकसित डायटम परीक्षण के लिए एक नई तकनीक है। इस तकनीक डायटम13,14 के विशिष्ट डीएनए अनुक्रम संरचना का विश्लेषण करके diatoms की प्रजातियों की पहचान का एहसास करता है. पीसीआर तकनीक और अनुक्रमण तकनीक आमतौर पर तकनीकी तरीकों का उपयोग किया जाता है, लेकिन उनका आधार डायटम से डीएनए का सफल निष्कर्षण है। हालांकि, डायटम में अन्य जीवों से अलग एक विशेष संरचना होती है, जिससे उनकी डीएनए निष्कर्षण तकनीक भी अलग हो जाती है।
डायटम की कोशिका भित्ति में सिलिसिफिकेशन की उच्च डिग्री होती है, और इसका मुख्य घटक सिलिकॉन डाइऑक्साइड 15,16,17 है। सिलिसियस सेल की दीवार बहुत कठिन है, और डीएनए निकालने से पहले इसे नष्ट कर दिया जाना चाहिए। साधारण डीएनए निष्कर्षण किट अक्सर डायटम डीएनए के निष्कर्षण के लिए सीधे उपयोग करने के लिए मुश्किल होती है क्योंकि वे डायटम18 के सिलिसियस खोल को नष्ट नहीं कर सकते हैं। इसलिए, डायटम के सिलिसियस खोल को नष्ट करना डायटम डीएनए निकालने में हल की जाने वाली प्रमुख तकनीकी समस्याओं में से एक है।
इसी समय, चूंकि फोरेंसिक अनुसंधान नमूनों में निहित डायटम की संख्या, चाहे पानी के नमूने या अंगों और डूबे हुए निकायों के ऊतक, अक्सर सीमित होते हैं, डायटम को समृद्ध करना आवश्यक है। संवर्धन का सार पदार्थों का पृथक्करण है। डायटम को एक साथ इकट्ठा करने की कोशिश करते समय, अन्य भौतिक घटकों (हस्तक्षेप करने वाले घटकों) की सामग्री को कम करें। फोरेंसिक काम में, प्रयोगशालाओं अक्सर अपकेंद्रित्र या झिल्ली निस्पंदन संवर्धन विधियों का उपयोग डायटम कोशिकाओं19 अलग करने के लिए. हालांकि, चूंकि वैक्यूम पंपिंग उपकरण का व्यापक रूप से उपयोग नहीं किया जाता है, इसलिए झिल्ली संवर्धन विधि का उपयोग अक्सर सामान्य प्राथमिक फोरेंसिक प्रयोगशालाओं में नहीं किया जाता है। तो, centrifugation विधि अभी भी आमतौर पर फोरेंसिक प्रयोगशालाओं20 में डायटम संवर्धन है.
डायटम से डीएनए निष्कर्षण वर्तमान में मुख्य रूप से फोरेंसिक अभ्यास में उपयोग किया जाता है, और इसके आवेदन के लिए महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। वर्तमान में, बाजार पर फोरेंसिक विज्ञान में उपयोग किए जाने वाले कुछ डायटम डीएनए निष्कर्षण किट हैं और वे आम तौर पर महंगेहैं 21. यह लेख एक बेहतर डायटम डीएनए निष्कर्षण विधि प्रदान करता है, जिससे डायटम डीएनए निष्कर्षण सरल, सुविधाजनक और लागत प्रभावी हो जाता है। यह डायटम के बाद के आणविक जीव विज्ञान परीक्षण के आवेदन को बढ़ाता है और डायटम परीक्षण के माध्यम से फोरेंसिक चिकित्सा में डूबने से संबंधित समस्याओं को बेहतर ढंग से हल कर सकता है। यह विधि कांच के मोतियों को जोड़कर और भंवर के लिए उपयुक्त समय निर्धारित करके डायटम की सिलिसियस सेल दीवारों को तोड़ती है। इस तरह, प्रोटीनेज K और बाध्यकारी समाधान तेजी से कोशिकाओं को लाइज़ करते हैं और कोशिकाओं में विभिन्न एंजाइमों को निष्क्रिय करते हैं। जीनोमिक डीएनए सोखना स्तंभ में मैट्रिक्स झिल्ली में अवशोषित होता है और अंत में क्षालन बफर द्वारा उत्सर्जित होता है। इस तरह के एक बेहतर पूरे रक्त जीन निष्कर्षण किट फोरेंसिक परीक्षा सामग्री में रक्त किट के डायटम डीएनए निष्कर्षण प्रभाव में सुधार करता है, फोरेंसिक अभ्यास में डायटम डीएनए निष्कर्षण की लागत को कम करता है, और जमीनी स्तर पर फोरेंसिक अनुसंधान के लिए बेहतर लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डायटम कोशिकाओं को कठोर सिलिसियस सेलदीवारों 17 द्वारा संरक्षित किया जाता है, और डायटम डीएनए निकालने के लिए इस संरचना को नष्ट किया जाना चाहिए। साधारण किट आसानी से डायटम के सिलिसियस खोल को नष्ट न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82060341,81560304) और हैनान प्रांत (YSPTZX202134) के शिक्षाविद इनोवेशन प्लेटफॉर्म वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित है।
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
