水試料および組織からの珪藻DNAの抽出
Summary
この記事は修正された共通のDNAの抽出のキットを使用して珪藻DNAの抽出のためのプロトコルを記述する。
Abstract
珪藻の検査は、死体が水中で溺死したかどうかを判断し、溺死した場所を推測するために、法医学の実践において不可欠な補助手段です。珪藻試験は、環境・プランクトンの分野においても重要な研究内容です。珪藻DNAを主な研究対象とする珪藻分子生物学的試験技術は、珪藻の新しい試験方法です。珪藻DNA抽出は、珪藻分子試験の基本です。現在、珪藻DNA抽出に一般的に使用されているキットは高価であり、関連する研究を実施するためのコストが増加します。私たちの研究室は、一般的な全血ゲノムDNA迅速抽出キットを改良し、満足のいく珪藻DNA抽出効果を得て、関連研究のためのガラスビーズに基づく代替の経済的で手頃な価格のDNA抽出ソリューションを提供しました。このプロトコルを使用して抽出された珪藻DNAは、PCRやシーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを満たすことができます。
Introduction
法医学の実践では、水中で発見された死体が溺死したのか、それとも死後に水中に投げ込まれたのかを判断することは、事件1の適切な解決に不可欠です。また、法医学の実践2において緊急に解決しなければならない難しい問題の1つでもあります。珪藻は自然環境(特に水中)に豊富に存在します3,4。溺死の過程で、低酸素症とストレス反応により、人々は激しい呼吸運動をし、溺れる液体を大量に吸い込みます。したがって、水中の珪藻は溺れた液体とともに肺に入り、一部の珪藻は肺胞毛細血管関門を介して血液循環に入り、血流とともに内臓に広がる可能性があります5,6。肺、肝臓、骨髄などの内部組織や臓器で珪藻が検出されることは、死ぬ前に溺死したことを示す強力な証拠です7,8。現在、法医学的珪藻試験は、主に形態学的試験方法に基づいています。組織の一連の前消化の後、未消化珪藻の形態学的定性的および定量的推定が顕微鏡下で行われる。この期間中は、硝酸などの危険で環境に優しくない試薬を使用する必要があります。このプロセスには時間がかかり、研究者は分類学の確かな専門知識と豊富な経験を持っている必要があります。これらはすべて、法医学スタッフに特定の課題をもたらします9.珪藻DNA検査技術は、近年開発された珪藻検査の新技術である10,11,12。本技術は、珪藻の特異的なDNA配列構成を解析することにより、珪藻の種同定を実現する13,14。PCR技術やシーケンシング技術は一般的に用いられる技術的手法ですが、その基本は珪藻からのDNA抽出の成功です。しかし、珪藻は他の生物とは異なる特殊な構造をしており、DNA抽出技術も異なります。
珪藻の細胞壁は珪化度が高く、その主成分は二酸化ケイ素15,16,17です。珪質細胞壁は非常に硬く、DNAを抽出する前に破壊する必要があります。通常のDNA抽出キットは、珪藻の珪質殻を破壊できないため、珪藻DNAの抽出に直接使用することは難しい場合が多い18。したがって、珪藻の殻を破壊することは、珪藻DNAを抽出する上で解決すべき重要な技術的問題の1つです。
同時に、法医学研究サンプルに含まれる珪藻の数は、水試料であろうと溺死体の臓器や組織であろうと、限られていることが多いため、珪藻を濃縮する必要があります。濃縮の本質は物質の分離です。珪藻をまとめようとするときは、他の材料成分(干渉成分)の含有量を最小限に抑えます。法医学研究では、実験室はしばしば遠心分離または膜ろ過濃縮法を使用して珪藻細胞を分離します19。しかし、真空ポンプ装置が広く使用されていないため、膜濃縮法は通常の一次法医学研究所ではあまり使用されていません。そのため、遠心分離法は、法医学研究所20において依然として一般的に珪藻濃縮である。
珪藻からのDNA抽出は、現在、主に法医学の現場で使用されており、その適用には大きな制限があります。現在、法医学で使用される珪藻DNA抽出キットは市場に出回っており、一般的に高価です21。この記事では、改良された珪藻DNA抽出法を提供し、珪藻DNA抽出を簡単、便利、かつ費用対効果の高いものにします。これにより、その後の珪藻の分子生物学的検査の適用が増加し、珪藻検査を通じて法医学における溺死に関連する問題をよりよく解決することができます。珪藻の珪質細胞壁をガラスビーズで壊し、渦に適切な時間を設定する方法です。このようにして、プロテイナーゼKと結合溶液は細胞を急速に溶解し、細胞内のさまざまな酵素を不活性化します。ゲノムDNAは吸着カラムのマトリックス膜に吸収され、最終的に溶出バッファーによって溶出されます。このような改良された全血遺伝子抽出キットは、法医学検査材料における血液キットの珪藻DNA抽出効果を向上させ、法医学診療における珪藻DNA抽出のコストを削減し、草の根法医学研究によりよく適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
珪藻細胞は硬い珪質細胞壁17によって保護されており、珪藻DNAを抽出するにはこの構造を破壊する必要があります。通常のキットでは、珪藻の珪質殻を簡単に破壊することはできません。したがって、珪藻DNA21の抽出に成功することは困難である。私たちの研究室では、最も一般的に使用されている血液DNA抽出キットを改良し、珪藻抽出の過程で異なる直径…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(82060341,81560304)と海南省アカデミーイノベーションプラットフォーム科学研究プロジェクト(YSPTZX202134)の支援を受けています。
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
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