본 연구에서는 대나무에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 하는 식물 유전자 발현 및 유전자 편집 방법의 새로운 방법을 개발하였다. 이 방법은 대나무의 유전자 기능 검증의 효율성을 크게 향상시켰으며, 이는 대나무 번식 과정을 가속화하는 데 중요한 의미를 갖습니다.
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이 논문에서
요약
초록
대나무에 대한 새로운 식물 유전자 형질 전환 방법이 개발되어 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 굳은살 유도 및 재생 과정이 필요하지 않습니다. 이 방법은 대나무 묘목에 대한 상처 및 진공을 통한 Agrobacterium 매개 유전자 발현을 포함합니다. 대나무 잎에서 RUBY 리포터 및 Cas9 유전자와 같은 외인성 유전자의 발현을 성공적으로 입증했습니다. 루비 묘목에서 베타린 축적에 대한 가장 높은 형질전환 효율은 GV3101 균주를 사용하여 감염 후 85.2%의 비율로 달성되었습니다. 외래 DNA는 대나무 게놈에 통합되지 않았지만 이 방법은 외인성 유전자를 발현하는 데 효율적이었습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 토착 리포터와 함께 유전자 편집 시스템도 개발되었는데, 이 방법에서 대나무 잎에서 편집된 대나무 비올라잔틴 탈에폭시다제 유전자(PeVDE)에 의해 생성된 in situ 돌연변이가 17.33%의 돌연변이율을 보입니다. PeVDE의 돌연변이로 인해 형광계로 정확하게 감지할 수 있는 높은 조명 하에서 비광화학적 담금질(NPQ) 값이 감소했습니다. 이것은 편집된 PeVDE를 대나무의 외인성 및 내인성 유전자 모두에 대한 잠재적인 네이티브 리포터로 만듭니다. PeVDE의 리포터와 함께 cinnamoyl-CoA reductase 유전자를 8.3%의 돌연변이율로 성공적으로 편집했습니다. 이 수술은 조직 배양 또는 굳은살 유도 과정을 피하여 대나무에서 외인성 유전자 및 내인성 유전자 편집을 빠르고 효율적으로 발현합니다. 이 방법은 유전자 기능 검증의 효율성을 향상시킬 수 있으며 대나무의 주요 대사 경로의 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
서론
대나무의 유전자 기능에 대한 연구는 대나무에 대한 이해를 높이고 유전자 변형의 가능성을 여는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이것의 효과적인 방법은 대나무 잎에 있는 Agrobacterium-mediated 감염의 과정을 통해 달성될 수 있다, 외인성 유전자를 포함하는 T-DNA 파편이 세포로 소개되는, 이어서 잎 세포 내의 유전자의 발현으로 이끌어 내는.
대나무는 제조, 예술 및 연구 분야에서 광범위하게 응용되는 귀중하고 재생 가능한 자원입니다. 대나무는 높은 기계적 강도, 인성, 적당한 강성 및 유연성1과 같은 우수한 목재 특성을 가지고 있으며 현재 칫솔, 빨대, 단추, 일회용 식기, 지하 파이프 라인 및 화력 발전용 냉각탑 충진재를 포함한 다양한 가정 및 산업 용품에 널리 사용됩니다. 따라서 대나무 육종은 플라스틱을 대체하고 플라스틱 사용량을 줄이며 환경을 보호하고 기후 변화에 대처할 수 있는 우수한 목재 특성을 가진 대나무 품종을 확보하고 상당한 경제적 가치를 창출하는 데 중요한 역할을 합니다.
그러나 전통적인 대나무 육종은 긴 식물 성장 단계와 불확실한 개화 기간으로 인해 어려움에 직면해 있습니다. 분자 육종 기술이 개발되어....
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프로토콜
1. 대나무 묘목의 준비
- 중국 광시성 구이린에서 수확한 씨앗을 사용하여 모소 대나무(Phyllostachys edulis) 묘목을 준비합니다. 씨앗을 2-3일 동안 물에 담그는 것으로 시작하여 매일 물을 갈아줍니다. 다음으로 흙과 질석을 3:1의 비율로 섞어 기질을 만듭니다.
- 발아를 위해 담근 씨앗을 기질에 뿌립니다. 실험실 조건에서 묘목을 유지하여 온도를 18-25 °C 사이로 유지하십시오. 광상 동안 250-350μmol/m2/s의 광도로 16시간 광주기/8시간 어두운 광주기를 보장합니다.
- 약 60%의 상대 습도를 유지합니다. Agrobacterium 감염의 경우 15 일 된 묘목을 사용하고 높이가 2-10cm 인 묘목을 사용하십시오.
알림: 대나무 개화는 예측할 수 없기 때문에 매년 씨앗을 구할 수 있는 것은 아닙니다. 씨앗은 일반적으로 건조한 환경에서 4 °C에서 2-3 년 동안 보관되며 여전히 20 % 이상의 생존력을 유지할 수 있습니다.
2. 플라스미드 및 아그로박테리움의 제조
- 플라스미드: 일시적인 발현 효과를 검증하....
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결과
대나무 잎의 질경이 유전자 발현에서 Agrobacterium 매개
RUBY 리포터 유전자는 티로신10에서 생생한 레드 베타린을 생산할 수 있는 능력으로 인해 일시적인 유전자 발현을 시각화하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 이 연구에서는 대나무 잎에서 외인성 RUBY 유전자를 일시적으로 발현하기 위해 Agrobacterium-mediated transformation을 활용했습니다(그림 1). 감염 후 3일째 되는 날에는 미성숙하게 접힌 잎에서 붉은색이 관찰되었고, 잎이 펼쳐진 후 5일째 되는 날에 더 선명해졌습니다(파란색 삼각형, 그림 1C). 이러한 결과는 아그로박테리움(Agrobacterium)이 대나무.......
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토론
이 방법은 일반적으로 1-2년이 소요되는 기존의 유전자 형질전환 방법에 비해 소요 시간을 크게 단축하고 5일 이내에 외인성 유전자의 일시적인 발현과 내인성 유전자의 유전자 편집을 달성합니다. 그러나 이 방법은 극히 일부의 세포만 변형시킬 수 있고, 유전자 편집 잎은 키메라성이며 완전한 식물로 재생되는 능력이 부족하기 때문에 한계가 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 식물 유전자 발현 및 유전자 편집 기술은 내인성 대나무 유전자의 기능적 검증을 위한 강력한 접근 방식을 제공합니다.
현재 식물에서 유전자 발현 및 유전자 편집 기술은 성숙한 잎이 아닌 미성숙한(말려진) 잎에서만 수행할 수 있습니다. 잎이 펼쳐지고 커짐에 따라 분열을 겪는 유전자 편집 세포의 수가 증가하여 특정 잎 영역에서 유전자 편집이 가능합니다. 그러나, 사용된 아그로박테리움 매개 형질전환 방법은 대나무 염색체에 외인성 T-DNA를 삽입하지 못하기 때문에 대나무
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공개 사항
저자는 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
저자들은 재정 지원을 해준 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(보조금 번호 2021YFD2200502), 중국 국립 자연과학 재단(보조금 번호 31971736)에 감사의 뜻을 전합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 35S::RUBY | Addgene, 미국 | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacter> | Biomed, | China BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | Agrobacterium 감염용 |
| CTAB | Sigma-Aldrich, 미국 | 57-09-0 | DNA 추출 |
| 이미징-PAM Fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | 나무 잎의 엽록소 형광 검출 | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, 독일 | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI 또는 Aar I | NEB, United States | R0745S | 타겟 염기서열을 CRISPR/Cas9 벡터에 통합합니다. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, 일본 | R045Q | 유전자 클로닝용 |
| T4 DNA 리가제 | NEB, 미국 | M0202V | CRISPR/Cas9 벡터에 타겟 염기서열을 통합합니다. |
참고문헌
- Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus M....
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재인쇄 및 허가
