In Planta Genexpression und Gen-Editierung in Moso-Bambusblättern
Summary
In dieser Studie wurde eine neuartige Genexpressions- und Geneditierungsmethode, die durch Agrobacterium vermittelt wird, in Bambus entwickelt. Diese Methode verbesserte die Effizienz der Genfunktionsvalidierung bei Bambus erheblich, was erhebliche Auswirkungen auf die Beschleunigung des Prozesses der Bambuszüchtung hat.
Abstract
Für Bambus wurde eine neuartige In-Planta-Gentransformationsmethode entwickelt, die zeit- und arbeitsintensive Kallusinduktions- und Regenerationsprozesse vermeidet. Diese Methode beinhaltet die Agrobacterium-vermittelte Genexpression durch Verwundung und Vakuum für Bambussetzlinge. Es wurde erfolgreich die Expression von exogenen Genen wie dem RUBY-Reporter und dem Cas9-Gen in Bambusblättern nachgewiesen. Die höchste Transformationseffizienz für die Akkumulation von Betalain in RUBY-Sämlingen wurde mit dem Stamm GV3101 mit einem Prozentsatz von 85,2 % nach der Infektion erreicht. Obwohl sich die fremde DNA nicht in das Bambusgenom integrierte, war die Methode effizient bei der Expression der exogenen Gene. Darüber hinaus wurde mit dieser Methode auch ein Gen-Editing-System mit einem nativen Reporter entwickelt, aus dem eine durch das editierte Bambus-Violaxanthin-De-Epoxidase-Gen (PeVDE) erzeugte in Bambusblättern eine In-situ-Mutante mit einer Mutationsrate von 17,33 % erzeugte. Die Mutation von PeVDE führte zu verringerten nicht-photochemischen Quenching-Werten (NPQ) unter starkem Licht, die mit einem Fluorometer genau nachgewiesen werden können. Dies macht den editierten PeVDE zu einem potentiellen nativen Reporter sowohl für exogene als auch für endogene Gene in Bambus. Mit dem Reporter von PeVDE wurde ein Cinnamoyl-CoA-Reduktase-Gen mit einer Mutationsrate von 8,3% erfolgreich editiert. Durch diese Operation wird der Prozess der Gewebekultur oder der Kallusinduktion vermieden, was für die Expression exogener Gene und die endogene Geneditierung in Bambus schnell und effizient ist. Diese Methode kann die Effizienz der Überprüfung der Genfunktion verbessern und dazu beitragen, die molekularen Mechanismen wichtiger Stoffwechselwege in Bambus aufzudecken.
Introduction
Die Untersuchung der Genfunktion in Bambus ist vielversprechend für das fortgeschrittene Verständnis von Bambus und die Erschließung seines Potenzials für genetische Modifikationen. Ein effektiver Weg hierfür kann durch den Prozess der Agrobacterium-vermittelten Infektion in Bambusblättern erreicht werden, bei dem das T-DNA-Fragment, das exogene Gene enthält, in die Zellen eingebracht wird, was anschließend zur Expression der Gene in den Blattzellen führt.
Bambus ist ein wertvoller und nachwachsender Rohstoff mit einem breiten Anwendungsspektrum in Fertigung, Kunst und Forschung. Bambus besitzt hervorragende Holzeigenschaften wie hohe mechanische Festigkeit, Zähigkeit, mäßige Steifigkeit und Flexibilität1, die heute in einer Vielzahl von Haushalts- und Industrieartikeln weit verbreitet sind, darunter Zahnbürsten, Strohhalme, Knöpfe, Einweggeschirr, unterirdische Rohrleitungen und Kühlturmfüller für die thermische Stromerzeugung. Daher spielt die Bambuszüchtung eine entscheidende Rolle bei der Gewinnung von Bambussorten mit hervorragenden Holzeigenschaften, um Kunststoffe zu ersetzen und den Kunststoffverbrauch zu reduzieren, die Umwelt zu schützen und den Klimawandel zu bekämpfen sowie einen erheblichen wirtschaftlichen Wert zu generieren.
Die traditionelle Bambuszüchtung steht jedoch aufgrund der langen vegetativen Wachstumsphase und der unsicheren Blütezeit vor Herausforderungen. Obwohl molekulare Züchtungstechniken entwickelt und auf die Bambuszüchtung angewendet wurden, ist der Prozess der Bambus-Gentransformation aufgrund der Kallusinduktions- und Regenerationsprozesse zeitaufwändig, arbeitsintensiv und kompliziert 2,3,4,5. Eine stabile genetische Transformation erfordert oft Agrobacterium-vermittelte Methoden, die Gewebekulturprozesse wie Kallusinduktion und Regeneration beinhalten. Bambus hat jedoch eine geringe Fähigkeit zur Kallusregeneration, was die Anwendung einer stabilen genetischen Transformation in Bambus stark einschränkt. Nachdem Agrobacterium Pflanzenzellen infiziert hat, dringt das T-DNA-Fragment in die Pflanzenzellen ein, wobei die Mehrheit der T-DNA-Fragmente nicht in die Zellen integriert bleibt, was zu einer vorübergehenden Expression führt. Nur ein kleiner Teil der T-DNA-Fragmente integriert sich zufällig in sein Chromosom, was zu einer stabilen Expression führt. Die transienten Expressionsniveaus zeigen eine Akkumulationskurve, die für jedes Gen, das aus einer von Agrobacterium gelieferten T-DNA exprimiert wird, variieren kann. In den meisten Fällen treten die höchsten Expressionsniveaus 3-4 Tage nach der Infiltration auf und nehmen nach 5-6 Tagen schnell ab 6,7. Frühere Studien haben gezeigt, dass mehr als 1/3 der Mutationen in geneditierten Pflanzen, die ohne Selektionsdruck für Resistenz erhalten wurden, auf die vorübergehende Expression von CRISPR/Cas9 zurückzuführen sind, während die restlichen weniger als 2/3 auf eine stabile Expression nach der DNA-Integration in das Genom zurückzuführensind 8. Dies deutet darauf hin, dass die Integration von T-DNA in das Pflanzengenom für die Genomierung nicht notwendig ist. Darüber hinaus hemmt der Selektionsdruck für Resistenzen das Wachstum nicht-transgener Zellen signifikant, was sich direkt auf den Regenerationsprozess infizierter Explantate auswirkt. Daher ist es möglich, durch die Verwendung einer transienten Expression ohne Selektionsdruck für Resistenz in Bambus eine nicht-integrierte Expression exogener Gene zu erreichen und die Genfunktion direkt in pflanzlichen Organen zu untersuchen. Somit kann eine einfache und zeitsparende Methode zur exogenen Genexpression und -editierung in Bambus9 entwickelt werden.
Die entwickelte exogene Genexpressions- und Geneditierungsmethode zeichnet sich durch ihre Einfachheit, Kosteneffizienz und den Verzicht auf teure Geräte oder komplexe Verfahren aus9. Bei dieser Methode wurde das endogene Violaxanthin-De-Epoxidase-Gen (PeVDE) aus Bambus als Reporter für die exogene Genexpression ohne Selektionsdruck verwendet. Dies liegt daran, dass das editierte PeVDE in Bambusblättern die Lichtschutzfähigkeit bei starkem Licht reduziert und eine Abnahme des nicht-photochemischen Quenching-Wertes (NPQ) zeigt, der durch Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung nachgewiesen werden kann. Um die Wirksamkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde ein weiteres endogenes Bambusgen, das Cinnamoyl-CoA-Reduktase-Gen (PeCCR5)9, mit diesem System ausgeschaltet und erfolgreich Mutanten dieses Gens erzeugt. Diese Technik kann für die funktionelle Charakterisierung von Genen verwendet werden, die Funktionen in Bambusblättern haben. Durch die vorübergehende Überexpression dieser Gene in Bambusblättern können ihre Expressionsniveaus erhöht werden, oder durch Gen-Editierung kann ihre Expression reduziert werden, was die Untersuchung von nachgeschalteten Genexpressionsniveaus, Blattphänotypen und Produktinhalten ermöglicht. Dies bietet einen effizienteren und praktikableren Ansatz für die Erforschung von Genfunktionen in Bambus. Diese Technik kann auf die funktionelle Charakterisierung von Genen angewendet werden, die in Bambusblättern funktionieren. Durch die vorübergehende Überexpression dieser Gene in Bambusblättern können ihre Expressionsniveaus erhöht werden, oder durch Gen-Editierung kann ihre Expression reduziert werden, was die Untersuchung von nachgeschalteten Genexpressionsniveaus, Blattphänotypen und Produktinhalten ermöglicht. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass aufgrund der umfangreichen Polyploidisierung die Mehrheit der kommerziell wichtigen Gene in Bambusgenomen in mehreren Kopien vorhanden ist, was zu genetischer Redundanz führt. Dies stellt eine Herausforderung für die Durchführung der Multiplex-Genom-Editierung in Bambus dar. Vor der Anwendung stabiler genetischer Transformations- oder Geneditierungstechniken ist es entscheidend, Genfunktionen schnell zu validieren. Bei der Lösung des Problems der Mehrfachkopien besteht ein Ansatz darin, Transkriptomexpressionsprofile zu analysieren, um Gene zu identifizieren, die in bestimmten Stadien aktiv exprimiert werden. Darüber hinaus ermöglicht das Targeting der konservierten funktionellen Domänen dieser Genkopien das Design gemeinsamer Zielsequenzen oder den Einbau mehrerer Zielstellen in denselben CRISPR/Cas9-Vektor, was den gleichzeitigen Knockout dieser Gene ermöglicht. Dies bietet einen effizienteren und praktikableren Ansatz für die Erforschung von Genfunktionen in Bambus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode reduziert den Zeitaufwand im Vergleich zu herkömmlichen genetischen Transformationsmethoden, die in der Regel 1-2 Jahre dauern, erheblich und erreicht eine vorübergehende Expression exogener Gene und eine Genom-Editierung endogener Gene innerhalb von 5 Tagen. Diese Methode hat jedoch ihre Grenzen, da sie nur einen kleinen Teil der Zellen transformieren kann und die geneditierten Blätter chimärisch sind und nicht in der Lage sind, sich zu vollständigen Pflanzen zu regenerieren. Nichtsdestotrotz bietet d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
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