I Planta Genuttrykk og genredigering i Moso Bamboo Leaves

Summary

I denne studien ble en roman i planta genuttrykk og genredigeringsmetode mediert av Agrobacterium utviklet i bambus. Denne metoden forbedret effektiviteten av genfunksjonsvalidering i bambus, noe som har betydelige implikasjoner for å akselerere prosessen med bambusavl.

Abstract

En ny metode for transformasjon av planta-genet ble utviklet for bambus, som unngår behovet for tidkrevende og arbeidskrevende callus-induksjons- og regenereringsprosesser. Denne metoden innebærer Agrobacterium-mediert genuttrykk via sår og vakuum for bambusplanter. Det demonstrerte vellykket uttrykket av eksogene gener, som RUBY-reporteren og Cas9-genet , i bambusblader. Den høyeste transformasjonseffektiviteten for akkumulering av betalain i RUBY-frøplanter ble oppnådd ved bruk av GV3101-stammen, med en prosentandel på 85,2% etter infeksjon. Selv om det fremmede DNA ikke ble integrert i bamdegenomet, var metoden effektiv til å uttrykke de eksogene genene. Videre er det også utviklet et genredigeringssystem med en innfødt reporter som bruker denne metoden, hvorfra en in situ mutant generert av det redigerte bambus violaxanthin de-epoxidase-genet (PeVDE) i bambusblader, med en mutasjonsrate på 17,33%. Mutasjonen av PeVDE resulterte i reduserte ikke-fotokjemiske slukkeverdier (NPQ) under høyt lys, som nøyaktig kan detekteres av et fluorometer. Dette gjør den redigerte PeVDE til en potensiell innfødt reporter for både eksogene og endogene gener i bambus. Med reporteren av PeVDE ble et cinnamoyl-CoA-reduktasegenet vellykket redigert med en mutasjonsrate på 8,3%. Denne operasjonen unngår prosessen med vevskultur eller kallusinduksjon, noe som er raskt og effektivt for å uttrykke eksogene gener og endogen genredigering i bambus. Denne metoden kan forbedre effektiviteten av genfunksjonsverifisering og vil bidra til å avsløre molekylære mekanismer for viktige metabolske veier i bambus.

Introduction

Undersøkelsen av genfunksjonen i bambus holder stort løfte om den avanserte forståelsen av bambus og låse opp potensialet for genetisk modifisering. En effektiv måte på dette kan oppnås gjennom prosessen med Agrobacterium-mediert infeksjon i bambusblader, hvorved T-DNA-fragmentet som inneholder eksogene gener blir introdusert i cellene, og deretter fører til ekspresjon av gener i bladcellene.

Bambus er en verdifull og fornybar ressurs med et bredt spekter av applikasjoner innen produksjon, kunst og forskning. Bambus har utmerkede treegenskaper som høy mekanisk styrke, seighet, moderat stivhet og fleksibilitet¹, som nå er mye brukt i en rekke husholdnings- og industrielle forsyninger, inkludert tannbørster, sugerør, knapper, engangsservise, underjordiske rørledninger og kjøletårnfyllstoffer for termisk kraftproduksjon. Derfor spiller bambusavl en avgjørende rolle i å skaffe bambusvarianter med gode treegenskaper for å erstatte plast og redusere plastbruk, beskytte miljøet og takle klimaendringer, samt generere betydelig økonomisk verdi.

Imidlertid står tradisjonell bambusavl overfor utfordringer på grunn av det lange vegetative vekststadiet og usikker blomstringsperiode. Selv om molekylære avlsteknikker har blitt utviklet og anvendt på bambusavl, er prosessen med bambusgentransformasjon tidkrevende, arbeidsintensiv og komplisert på grunn av callus-induksjons- og regenereringsprosessene 2,3,4,5. Stabil genetisk transformasjon krever ofte Agrobacterium-medierte metoder, som involverer vevskulturprosesser som kallusinduksjon og regenerering. Imidlertid har bambus en lav evne til kallusregenerering, noe som i stor grad begrenser anvendelsen av stabil genetisk transformasjon i bambus. Etter at Agrobacterium infiserer planteceller, kommer T-DNA-fragmentet inn i plantecellene, med flertallet av T-DNA-fragmenter som forblir ikke-integrert i cellene, noe som resulterer i forbigående ekspresjon. Bare en liten del av T-DNA-fragmentene integreres tilfeldig i kromosomet, noe som fører til stabilt uttrykk. De forbigående ekspresjonsnivåene viser en akkumuleringskurve som kan variere for hvert gen uttrykt fra et Agrobacterium-levert T-DNA. I de fleste tilfeller oppstår de høyeste uttrykksnivåene 3-4 dager etter infiltrasjon og reduseres raskt etter 5-6 dager ^6,7. Tidligere studier har vist at mer enn 1/3 av mutasjonene i genredigerte planter oppnådd uten seleksjonspress for resistens kommer fra det forbigående uttrykket av CRISPR/Cas9, mens de resterende mindre enn 2/3 kommer fra stabilt uttrykk etter DNA-integrasjon i genomet⁸. Dette indikerer at T-DNA-integrasjon i plantegenomet ikke er nødvendig for genredigering. Videre hemmer seleksjonstrykk for resistens signifikant veksten av ikke-transgene celler, som direkte påvirker regenereringsprosessen av infiserte eksplanter. Ved å bruke transient ekspresjon uten seleksjonspress for resistens i bambus, er det derfor mulig å oppnå ikke-integrert ekspresjon av eksogene gener og studere genfunksjon direkte i planteorganer. Derfor kan en enkel og tidsbesparende metode utvikles for eksogent genuttrykk og redigering i bambus⁹.

Den utviklede eksogene genuttrykks- og genredigeringsmetoden er preget av dens enkelhet, kostnadseffektivitet og fravær av dyrt utstyr eller komplekse prosedyrer⁹. I denne metoden ble bambus endogent violaxanthin de-epoxidase genet (PeVDE) brukt som reporter for eksogent genuttrykk uten seleksjonstrykk. Dette skyldes at den redigerte PeVDE i bambusblader reduserer fotobeskyttelsesevnen under høyt lys og demonstrerer en reduksjon i ikke-fotokjemisk slukking (NPQ) -verdien, som kan detekteres gjennom klorofyllfluorescensavbildning. For å demonstrere effektiviteten av denne metoden ble et annet bambus endogent gen, cinnamoyl-CoA-reduktasegenet (PeCCR5) ⁹, slått ut ved hjelp av dette systemet og vellykket generert mutanter av dette genet. Denne teknikken kan brukes til funksjonell karakterisering av gener som har funksjoner i bambusblader. Ved å overuttrykke disse genene forbigående i bambusblader, kan deres uttrykksnivåer forbedres, eller ved genredigering kan uttrykket deres slås ned, noe som muliggjør studier av nedstrøms genuttrykksnivåer, bladfenotyper og produktinnhold. Dette gir en mer effektiv og gjennomførbar tilnærming til genfunksjonsforskning i bambus. Denne teknikken kan brukes til funksjonell karakterisering av gener som fungerer i bambusblader. Ved å overuttrykke disse genene forbigående i bambusblader, kan deres uttrykksnivåer forbedres, eller ved genredigering kan uttrykket deres slås ned, noe som muliggjør studier av nedstrøms genuttrykksnivåer, bladfenotyper og produktinnhold. I tillegg er det viktig å merke seg at, på grunn av omfattende polyploidisering, er flertallet av kommersielt viktige gener i bamdegenomer til stede i flere kopier, noe som resulterer i genetisk redundans. Dette utgjør en utfordring for å utføre multiplex genomredigering i bambus. Før bruk av stabil genetisk transformasjon eller genredigeringsteknikker, er det avgjørende å raskt validere genfunksjoner. Ved å ta opp spørsmålet om flere genkopier, er en tilnærming å analysere transkriptomuttrykksprofiler for å identifisere gener som uttrykkes aktivt under bestemte stadier. Videre tillater målretting av de konserverte funksjonelle domenene til disse genkopiene utforming av felles målsekvenser eller inkorporering av flere målsteder i samme CRISPR / Cas9-vektor, noe som muliggjør samtidig knockout av disse genene. Dette gir en mer effektiv og gjennomførbar tilnærming til genfunksjonsforskning i bambus.

Protocol

1. Tilberedning av bambusplanter Forbered moso bambus (Phyllostachys edulis) frøplanter ved hjelp av frø høstet i Guilin, Guangxi, Kina. Begynn med å suge frøene i vann i 2-3 dager, og sørg for å bytte vann daglig. Deretter lager du et substrat ved å blande jord og vermikulitt i forholdet 3: 1. Så de gjennomvåt frøene i underlaget for spiring. Vedlikehold plantene under laboratorieforhold, og hold temperaturen mellom 18-25 °C. Sørg for en 16 timers lys / 8 t mø…

Representative Results

Agrobacterium-mediert i planta genuttrykk i bambusbladerRUBY reporter-genet har vist seg å være effektivt for å visualisere forbigående genuttrykk på grunn av dets evne til å produsere levende rød betalain fra tyrosin10. I denne studien ble Agrobacterium-mediert transformasjon benyttet til å transient uttrykke det eksogene RUBY-genet i bambusblader (figur 1). På 3dager etter infeksjo…

Discussion

Denne metoden reduserer tiden som kreves betydelig sammenlignet med tradisjonelle genetiske transformasjonsmetoder, som vanligvis tar 1-2 år, og oppnår forbigående ekspresjon av eksogene gener og genredigering av endogene gener innen 5 dager. Denne metoden har imidlertid begrensninger, da den bare kan transformere en liten andel celler, og de genredigerte bladene er kimære og mangler evnen til å regenerere til komplette planter. Likevel gir dette i planta genuttrykk og genredigeringsteknologi en kraftig til…

Materials

35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.