JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

مورين هند نموذج زرع الأطراف لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام وتر العرقوب

Published: December 08, 2023
doi:
10.3791/65801
, , ,
1Department of Biomedical Engineering,University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research,University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology,University of Rochester Medical Center

Summary

نقدم منصة تجريبية مخصصة وبروتوكول زراعة الأنسجة الذي يعيد إنشاء التغيير الغضروفي الليفي المدفوع بتأثير إدخال وتر العرقوب في نباتات الأطراف الخلفية للفأر مع بقاء الخلية المستدامة ، مما يوفر نموذجا مناسبا لاستكشاف البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار.

Abstract

يؤدي اصطدام الأوتار بالعظام إلى توليد بيئة إجهاد ميكانيكية متعددة المحاور مع إجهاد ضاغط عرضي مرتفع بشكل ملحوظ ، مما يثير نمطا ظاهريا لغضروفا ليفيا موضعيا يتميز بتراكم المصفوفة الغنية بالجليكوزامينوجليكان (GAG) وإعادة تشكيل شبكة الكولاجين. في حين أن الغضروف الليفي هو سمة طبيعية في المناطق المصابة من الأوتار السليمة ، فإن ترسب GAG الزائد وعدم تنظيم شبكة الكولاجين هي السمات المميزة لاعتلال الأوتار. وفقا لذلك ، يتم التعرف سريريا على الاصطدام كعامل خارجي مهم في بدء وتطور اعتلال الأوتار. ومع ذلك ، فإن البيولوجيا الميكانيكية الكامنة وراء اصطدام الأوتار لا تزال قيد الدراسة. أدت الجهود السابقة لتوضيح الاستجابة الخلوية لاصطدام الأوتار إلى تطبيق ضغط أحادي المحور على الخلايا واستئصال الأوتار في المختبر. ومع ذلك ، تفتقر الخلايا المعزولة إلى بيئة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد حاسمة للاستجابة الميكانيكية ، وتفشل كل من الدراسات في المختبر والدراسات المختبرية المستأصلة في تلخيص بيئة الإجهاد متعدد المحاور الناتجة عن اصطدام الأوتار في الجسم الحي ، والذي يعتمد على السمات التشريحية للمنطقة الاصطدامية. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي ، تفتقر نماذج اصطدام الأوتار إلى السيطرة على بيئة الإجهاد الميكانيكي. للتغلب على هذه القيود ، نقدم نموذجا جديدا لزرع الأطراف الخلفية للفأر مناسبا لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام وتر العرقوب. يحافظ هذا النموذج على وتر العرقوب في الموقع للحفاظ على التشريح المحلي ويعيد إنتاج بيئة الإجهاد متعددة المحاور الناتجة عن اصطدام إدخال وتر العرقوب على العقبي أثناء الانثناء الظهري للكاحل المطبق بشكل سلبي مع الاحتفاظ بالخلايا داخل بيئتها الأصلية. نحن نصف بروتوكول زراعة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من هذا النموذج ونقدم البيانات التي تثبت استمرارية النبات المستدام على مدار 7 أيام. تظهر النتائج التمثيلية تلطيخا محسنا نسيجيا وانخفاضا في محاذاة ألياف الكولاجين الثانوية للاصطدام ، مما يشير إلى ارتفاع تكوين الغضروف الليفي. يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة للتحقيق في أنظمة التحميل الميكانيكية المختلفة ويسمح بمعالجة المسارات الجزيئية ذات الأهمية لتحديد الآليات التي تتوسط تغيير النمط الظاهري في وتر العرقوب استجابة للاصطدام.

Introduction

تعاني العديد من الأوتار ، بما في ذلك وتر العرقوب وأوتار الكفة المدورة ، من اصطدام عظمي بسبب الوضع التشريحي الطبيعي1,2,3,4. يؤدي اصطدام الأوتار إلى توليد إجهاد ضاغط موجه بشكل عرضي إلى محور الألياف الطولي5,6,7. تظهر مناطق اصطدام الأوتار نمطا ظاهريا فريدا للغضروف الليفي يتم فيه تضمين الخلايا المستديرة المنكمشة (الخلايا الليفية الغضروفية) داخل شبكة كولاجين غير منظمة مع زيادة ملحوظة في محتوى الجليكوزامينوجليكان (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. تشير الدراسات السابقة إلى أن البيئة الميكانيكية المتباينة الناتجة عن اصطدام الأوتار تحافظ على هذه المصفوفة الغنية ب GAG من خلال دفع ترسب البروتيوغليكان المتجمع الكبير ، وأبرزها aggrecan ، على الرغم من أن الآليات الأساسية غير واضحة.1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. في حين أن الغضروف الليفي هو سمة طبيعية في المناطق المصابة من الأوتار السليمة ، فإن استقلاب البروتيوغليكان الشاذ المرتبط بتكوين الغضروف الليفي المفرط هو سمة مميزة لاعتلال الأوتار ، وهو مرض شائع وموهن يظهر بشكل غير متناسب في الأوتار المصابة بشكل مزمن.1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. وفقا لذلك ، يتم التعرف سريريا على اصطدام الأوتار كعامل خارجي مهم يقود العديد من اعتلالات الأوتار الأكثر شيوعا ، بما في ذلك مرض الكفة المدورة واعتلال وتر العرقوب (IAT)50,51,52. حاليا ، علاج اعتلال الأوتار غير فعال. على سبيل المثال ، ما يقرب من 47 ٪ من المرضى الذين يعانون من IAT يحتاجون إلى تدخل جراحي بعد فشل الإدارة المحافظة ، مع نتائج متغيرة بعد الجراحة53,54,55,56. على الرغم من العلاقة الواضحة بين الاصطدام واعتلال الأوتار ، فإن الآليات الميكانيكية البيولوجية التي تستشعر بها الخلايا في الأوتار الاصطدامية وتستجيب لبيئتها الميكانيكية موصوفة بشكل سيئ ، مما يحجب فهم التسبب في اعتلال الأوتار ويؤدي إلى علاج غير كاف.

نماذج Explant هي أدوات مفيدة في دراسة علم الأحياء الميكانيكية الأوتار57,58. كخطوة أولى نحو فهم البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار ، استكشفت العديد من الدراسات السابقة الاستجابة الخلوية بعد تطبيق الضغط البسيط أحادي المحور على الخلايا أو استئصالالأوتار 27،29،30،31،32،33،34،39. ومع ذلك ، تفتقر الخلايا في المختبر إلى مصفوفات خارج الخلية وحول الخلية تسهل نقل الإجهاد ، وتعزل عوامل النمو المهمة والسيتوكينات المنبعثة عن التشوه الميكانيكي ، وتوفر ركيزة لمجمعات الالتصاق البؤري التي تلعب دورا في النقل الميكانيكي57,59. بالإضافة إلى ذلك ، فشلت كل من الدراسات المختبرية والدراسات المزعزلة في تلخيص بيئة الإجهاد الميكانيكي متعدد المحاور الناتجة عن اصطدام الأوتار في الجسم الحي ، والذي يعتمد على السمات التشريحية للمنطقة الاصطدامية 5,6. في سياق إدخال وتر العرقوب الاصطدام ، يشمل ذلك الأنسجة المحيطة مثل الجراب العقبي الخلفي ووسادة الدهونKager 60،61،62،63. على العكس من ذلك ، في الجسم الحي تسمح نماذج اصطدام الأوتار25،28،36،37،38،64،65،66 بالحد الأدنى من التحكم في حجم وتواتر الحمل المطبق مباشرة على الوتر ، وهو قيد معترف به جيدا للنماذج في الجسم الحي لدراسة علم الأحياء الميكانيكي للوتر57,58، 67,68,69,70. نظرا للتحديات في قياس إجهاد الأوتار في الجسم الحي ، فإن بيئة الإجهاد الداخلية المتولدة داخل هذه النماذج غالبا ما تكون سيئة التوصيف بشكل جيد.

في هذه المخطوطة ، نقدم منصة تجريبية مخصصة تعيد إنشاء اصطدام إدخال وتر العرقوب على العقبي داخل نباتات الأطراف الخلفية الكاملة للفئران والتي ، عند إقرانها ببروتوكول زراعة الأنسجة هذا ، تحافظ على صلاحيتها على مدار 7 أيام في زراعة النباتات وتسمح بدراسة العواقب البيولوجية لاصطدام الأوتار. تم بناء المنصة على قاعدة حمض اللبنيك المطبوعة ثلاثية الأبعاد (PLA) التي توفر الأساس لربط المقابض وإدراج تقليل حجم PLA المطبوع ثلاثي الأبعاد. تستخدم المقابض لتثبيت الجزء العلوي من الساق والركبة بالقرب من تقاطع الوتر العضلي للأخيل مع الجانب الذيلي للطرف الخلفي متجها لأعلى ، مما يسمح بتصوير وتر العرقوب من الأعلى باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية أو المجهر المقلوب (الشكل 1 أ). ينزلق إدراج تقليل الحجم على طول مسار على القاعدة ويقلل من الحجم المطلوب لوسائط زراعة الأنسجة. يتم توجيه خط مضفر ملفوف حول مخلب الخلف من المنصة باستخدام التصميم الأساسي ومقطع PLA مطبوع 3D. عن طريق سحب الخيط ، يتم ثني المخلب الخلفي ظهريا ، ويصطدم إدخال وتر العرقوب بالعقبي ، مما يؤدي إلى إجهاد ضغط عرضي مرتفع 5,6 (الشكل 1 أ). تحتوي المنصة داخل حمام أكريليك يحافظ على نباتات الأطراف الخلفية المغمورة في وسائط زراعة الأنسجة. يحافظ تثبيت الخيط المشدود إلى خارج الحمام بشريط لاصق على انثناء ظهر الكاحل لإنتاج اصطدام ثابت بإدخال وتر العرقوب. يتم توفير ملفات CAD للمكونات المطبوعة 3D في أشكال متعددة (ملف تكميلي 1) ، مما يسمح بالاستيراد إلى مجموعة من برامج CAD التجارية والمجانية والمفتوحة المصدر لتعديلها لتناسب الاحتياجات التجريبية. إذا لم يكن الوصول إلى طابعات 3D متاحا للتصنيع ، فيمكن توفير ملفات CAD لخدمات الطباعة ثلاثية الأبعاد عبر الإنترنت التي ستقوم بطباعة الأجزاء وشحنها بتكلفة منخفضة.

الأهم من ذلك ، أن مجمع ثلاثية الرؤوس surae-Achilles العضلي يمتد على مفاصل الركبة والكاحل71،72،73. وبالتالي ، يتأثر إجهاد الشد في وتر العرقوب بثني الركبة. تمديد الركبة يضع وتر العرقوب تحت التوتر ، في حين أن ثني الركبة يقلل من التوتر. من خلال تمديد الركبة أولا ثم ثني الكاحل بشكل سلبي ، يمكن فرض سلالات الضغط عند الإدخال الاصطدام على سلالات الشد. على العكس من ذلك ، من خلال ثني الكاحل بشكل سلبي مع ثني الركبة ، يتم تقليل إجهاد الشد ، ويبقى الإجهاد الضاغط. ويستكشف البروتوكول الحالي ثلاثة شروط من هذا القبيل. 1) بالنسبة للاصطدام الثابت ، يتم ثني القدم ظهريا إلى < 110 درجة فيما يتعلق بالساق لاصطدام الإدخال ، مع ثني الركبة لتقليل التوتر. 2) بالنسبة لمجموعة التوتر الأساسية ، يتم تمديد الكاحل فوق 145 درجة من الانثناء الظهري مع تمديد الركبة ، مما يولد إجهادا للشد في الغالب عند الإدخال. 3) بالنسبة للمجموعة المفرغة ، يتم استزراع النباتات الخارجية في طبق بتري مع الركبة والكاحل في أوضاع محايدة في حالة عدم وجود حمل مطبق خارجيا. يتم قياس الزوايا المشار إليها أعلاه فوتوغرافيا بالنسبة لنظام الإحداثيات حيث تكون القدم والساق متوازيتين بزاوية 180 درجة وعمودية بزاوية 90 درجة.

تشمل الخطوات الرئيسية للبروتوكول 1) تشريح نباتات الأطراف الخلفية والإزالة الدقيقة للجلد والوتر الأخمصي. 2) زراعة النباتات بعد المعالجة المسبقة للديكساميثازون لمدة 48 ساعة ؛ 3) تقسيم الأنسجة وتلطيخ النسيجية. و 4) تحليل الصور الملونة لتقييم تكوين الغضروف الليفي. بعد التشريح ، تتم معالجة كل نبتة طرف خلفي لمدة 48 ساعة في وسط الاستزراع المكمل بديكساميثازون74. يتم تعيين الأطراف المقابلة من كل فأر لمجموعات تجريبية منفصلة للمقارنة الزوجية ، مما يساعد على التحكم في التباين البيولوجي. بعد المعالجة المسبقة ، يتم وضع النباتات في منصات كما هو موضح أعلاه وزراعتها لمدة 7 أيام أخرى (الشكل 1 ب). يتم إجراء مقارنات إضافية مع مجموعة المعالجة مسبقا (اليوم 0) حيث تتم إزالة النباتات مباشرة بعد المعالجة المسبقة لمدة 48 ساعة.

بعد زراعة النباتات ، يتم قطع الأطراف الخلفية ، وتثبيت الفورمالين ، وإزالة الكلس ودمجها في البارافين. يوفر التقسيم التسلسلي في الاتجاه السهمي تصورا لوتر العرقوب من الوصلة العضلية إلى الإدخال العقبي مع السماح بتتبع عمق القسم عبر الوتر بأكمله. يستخدم وضع العلامات الطرفية dUTP X-nick بوساطة dUTP X-nick (TUNEL) لتصور تلف الحمض النووي الثانوي لموت الخلايا المبرمج وتقييم الجدوى. يتم إجراء الأنسجة الزرقاء Toluidine وتحليل الصور الملونة المخصصة لتحديد التغيرات في تلطيخ GAG. ثم يتم استخدام أقسام الأنسجة الملطخة باللون الأزرق Toluidine لتصوير SHG لتوصيف التغيرات في تنظيم ألياف الكولاج (الشكل 1B).

تشير النتائج التمثيلية المقدمة إلى تغير التلوين النسيجي للمصفوفة الغنية ب GAG وعدم تنظيم شبكة الكولاجين خارج الخلية الناتجة عن 7 أيام من الاصطدام الساكن داخل النموذج. يمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء التغير الغضروفي الليفي الناجم عن الاصطدام.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة الموارد الحيوانية بجامعة روتشستر. 1. إعداد وسائط زراعة الأنسجة استزراع جميع النباتات في وسط النسر المعدل من Dulbecco (1x DMEM) مع 1٪ v / v البنسلين – الستربتومايسين و 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك L في حاضنة عند 37 درجة مئوي?…

Representative Results

تظهر الصور التمثيلية لأقسام الأنسجة الملطخة TUNEL الحد الأدنى من نوى موت الخلايا المبرمج داخل جسم وتر العرقوب بعد 7 أيام من زراعة النباتات عبر المجموعات التجريبية (الشكل 2 أ). يوفر القياس الكمي لهذه الصور دليلا على أن بروتوكول زراعة الأنسجة يحافظ على ما يصل إلى 78٪ من الصلاحية ?…

Discussion

توفر منصة زرع الأطراف الخلفية التجريبية للفأر المقترنة ببروتوكول زراعة الأنسجة الموصوف في هذه الدراسة نموذجا مناسبا لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لتشكيل الغضروف الليفي الناجم عن الاصطدام عند إدخال وتر العرقوب. تتجلى فائدة هذا النموذج الخارجي من خلال النتائج التمثيلية ، والتي تشير إلى …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشعر المؤلفون بالامتنان للدعم والمساعدة التي قدمها جيف فوكس وفيديا فينكاتراماني من مركز أبحاث الأنسجة والكيمياء الحيوية والتصوير الجزيئي (HBMI) التابع لمركز أبحاث الجهاز العضلي الهيكلي بجامعة روتشستر ، بتمويل جزئي من P30AR06965. بالإضافة إلى ذلك ، يود المؤلفون أن يشكروا مركز الفحص المجهري الضوئي والنانوي (CALMN) في المركز الطبي بجامعة روتشستر للمساعدة في الفحص المجهري متعدد الفوتونات. تم تمويل هذه الدراسة من قبل R01 AR070765 و R01 AR070765-04S1 ، وكذلك 1R35GM147054 و 1R01AR082349.

Materials

Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox – Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert – – 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cook, J. L., Purdam, C. Is compressive load a factor in the development of tendinopathy. Br J Sports Med. 46 (3), 163-168 (2012).
  2. Benjamin, M., Qin, S., Ralphs, J. R. Fibrocartilage associated with human tendons and their pulleys. J Anat. 187 (Pt 3), 625-633 (1995).
  3. Benjamin, M., Ralphs, J. R. Fibrocartilage in tendons and ligaments – an adaptation to compressive load. J Anat. 193 (4), 481-494 (1998).
  4. Benjamin, M., Theobald, P., Suzuki, D., Toumi, H. The anatomy of the Achilles tendon. The Achilles Tendon. 3, 5-16 (2007).
  5. Chimenti, R. L., et al. Insertional achilles tendinopathy associated with altered transverse compressive and axial tensile strain during ankle dorsiflexion. J Orthop Res. 35 (4), 910-915 (2017).
  6. Mora, K. E., et al. Ultrasound strain mapping of the mouse Achilles tendon during passive dorsiflexion. J Biomech. 132, 110920 (2022).
  7. Pringels, L., et al. Intratendinous pressure changes in the Achilles tendon during stretching and eccentric loading: Implications for Achilles tendinopathy. Scand J Med Sci Sports. 33 (5), 619-630 (2023).
  8. Koob, T. J., Vogel, K. G. Site-related variations in glycosaminoglycan content and swelling properties of bovine flexor tendon. J Orthop Res. 5 (3), 414-424 (1987).
  9. Vogel, K. G., Koob, T. J. Structural specialization in tendons under compression. Int Rev Cytol. 115, 267-293 (1989).
  10. Vogel, K. G., Ordög, A., Pogány, G., Oláh, J. Proteoglycans in the compressed region of human tibialis posterior tendon and in ligaments. J Orthop Res. 11 (1), 68-77 (1993).
  11. Vogel, K. G., Sandy, J. D., Pogány, G., Robbins, J. R. Aggrecan in bovine tendon. Matrix Biol. 14 (2), 171-179 (1994).
  12. Robbins, J. R., Vogel, K. G. Regional expression of mRNA for proteoglycans and collagen in tendon. Eur J Cell Biol. 64 (2), 264-270 (1994).
  13. Vogel, K., Gordon, S. I., Blair, S. J., Fine, L. J. . Repetitive motion disorders of the upper extremity. , (1995).
  14. Benjamin, M., Tyers, R. N., Ralphs, J. R. Age-related changes in tendon fibrocartilage. J Anat. 179, 127-136 (1991).
  15. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: a structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anat Rec. 231 (2), 167-177 (1991).
  16. Rufai, A., Benjamin, M., Ralphs, J. R. Development and ageing of phenotypically distinct fibrocartilages associated with the rat Achilles tendon. Anat Embryol (Berl). 186 (6), 611-618 (1992).
  17. Rufai, A., Ralphs, J. R., Benjamin, M. Ultrastructure of fibrocartilages at the insertion of the rat Achilles tendon. J Anat. 189 (Pt 1), 185-191 (1996).
  18. Waggett, A. D., Ralphs, J. R., Kwan, A. P. L., Woodnutt, D., Benjamin, M. Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human achilles tendon. Matrix Biol. 16 (8), 457-470 (1998).
  19. Ralphs, J., et al. Regional differences in cell shape and gap junction expression in rat Achilles tendon: relation to fibrocartilage differentiation. J Anat. 193 (pt 2), 215-222 (1998).
  20. Milz, S., et al. Three-dimensional reconstructions of the Achilles tendon insertion in man. J Anat. 200 (Pt 2), 145-152 (2002).
  21. Tischer, T., Milz, S., Maier, M., Schieker, M., Benjamin, M. An immunohistochemical study of the rabbit suprapatella, a sesamoid fibrocartilage in the quadriceps tendon containing aggrecan. J Histochem Cytochem. 50 (7), 955-960 (2002).
  22. Esquisatto, M. A., Joazeiro, P. P., Pimentel, E. R., Gomes, L. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 31 (6), 570-577 (2007).
  23. Matuszewski, P. E., et al. Regional variation in human supraspinatus tendon proteoglycans: Decorin, biglycan, and aggrecan. Connect Tissue Res. 53 (5), 343-348 (2012).
  24. Buckley, M. R., Huffman, G. R., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. The location-specific role of proteoglycans in the flexor carpi ulnaris tendon. Connect Tissue Res. 54 (6), 367-373 (2013).
  25. Gillard, G. C., Reilly, H. C., Bell-Booth, P. G., Flint, M. H. The influence of mechanical forces on the glycosaminoglycan content of the rabbit flexor digitorum profundus tendon. Connect Tissue Res. 7 (1), 37-46 (1979).
  26. Giori, N. J., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Cellular shape and pressure may mediate mechanical control of tissue composition in tendons. J Orthop Res. 11 (4), 581-591 (1993).
  27. Wren, T. A., Beaupré, G. S., Carter, D. R. Mechanobiology of tendon adaptation to compressive loading through fibrocartilaginous metaplasia. J Rehabil Res Dev. 37 (2), 135-143 (2000).
  28. Malaviya, P., et al. An in vivo model for load-modulated remodeling in the rabbit flexor tendon. J Orthop Res. 18 (1), 116-125 (2000).
  29. Shim, J. W., Elder, S. H. Influence of Cyclic Hydrostatic Pressure on Fibrocartilaginous Metaplasia of Achilles Tendon Fibroblasts. Biomech Model Mechanobiol. 5 (4), 247-252 (2006).
  30. Koob, T. J., Clark, P. E., Hernandez, D. J., Thurmond, F. A., Vogel, K. G. Compression loading in vitro regulates proteoglycan synthesis by tendon fibrocartilage. Arch Biochem Biophys. 298 (1), 303-312 (1992).
  31. Evanko, S. P., Vogel, K. G. Proteoglycan Synthesis in Fetal Tendon Is Differentially Regulated by Cyclic Compression in Vitro. Arch Biochem Biophys. 307 (1), 153-164 (1993).
  32. Vogel, K. G. The effect of compressive loading on proteoglycan turnover in cultured fetal tendon. Connect Tissue Res. 34 (3), 227-237 (1996).
  33. Thornton, G. M., et al. Changes in mechanical loading lead to tendon specific alterations in MMP and TIMP expression: influence of stress deprivation and intermittent cyclic hydrostatic compression on rat supraspinatus and Achilles tendons. Br J Sports Med. 44 (10), 698-703 (2010).
  34. Robbins, J. R., Evanko, S. P., Vogel, K. G. Mechanical Loading and TGF-β Regulate Proteoglycan Synthesis in Tendon. Arch Biochem Biophys. 342 (2), 203-211 (1997).
  35. Docking, S., Samiric, T., Scase, E., Purdam, C., Cook, J. Relationship between compressive loading and ECM changes in tendons. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (1), 7-11 (2013).
  36. Wang, X., et al. Aberrant TGF-β activation in bone tendon insertion induces enthesopathy-like disease. J Clin Invest. 128 (2), 846-860 (2018).
  37. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. J Orthop Res. 36 (10), 2780-2788 (2018).
  38. Liu, Y., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: development and analysis of a novel rat model. J Shoulder Elbow Surg. 31 (9), 1898-1908 (2022).
  39. Majima, T., et al. Compressive compared with tensile loading of medial collateral ligament scar in vitro uniquely influences mRNA levels for aggrecan, collagen type II, and collagenase. J Orthop Res. 18 (4), 524-531 (2000).
  40. Hopkins, C., et al. Critical review on the socio-economic impact of tendinopathy. Asia Pac J Sports Med, Arthrosc, Rehabil Technol. 4, 9-20 (2016).
  41. Scott, A., Ashe, M. C. Common tendinopathies in the upper and lower extremities. Curr Sports Med Rep. 5 (5), 233-241 (2006).
  42. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin Sports Med. 22 (4), 675-692 (2003).
  43. Bah, I., et al. Tensile mechanical changes in the Achilles tendon due to Insertional Achilles tendinopathy. J Mech Behav Biomed Mater. 112, 104031 (2020).
  44. Maffulli, N., Reaper, J., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Barrass, V. Chondral Metaplasia in Calcific Insertional Tendinopathy of the Achilles Tendon. Clin J Sport Med. 16 (4), 329-334 (2006).
  45. Corps, A. N., et al. Increased expression of aggrecan and biglycan mRNA in Achilles tendinopathy. Rheumatology (Oxford). 45 (3), 291-294 (2006).
  46. Scott, A., et al. Increased versican content is associated with tendinosis pathology in the patellar tendon of athletes with jumper’s knee. Scand J Med Sci Sports. 18 (4), 427-435 (2008).
  47. Attia, M., et al. Greater glycosaminoglycan content in human patellar tendon biopsies is associated with more pain and a lower VISA score. Br J Sports Med. 48 (6), 469-475 (2014).
  48. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J. Cumulative Incidence of Achilles Tendon Rupture and Tendinopathy in Male Former Elite Athletes. Clin J Sport Med. 15 (3), 133-135 (2005).
  49. Corps, A. N., et al. Changes in matrix protein biochemistry and the expression of mRNA encoding matrix proteins and metalloproteinases in posterior tibialis tendinopathy. Ann Rheum Dis. 71 (5), 746-752 (2012).
  50. Neer, C. S. Anterior acromioplasty for the chronic impingement syndrome in the shoulder: a preliminary report. J Bone Joint Surg Am. 54 (1), 41-50 (1972).
  51. Bigliani, L. U., Ticker, J. B., Flatow, E. L., Soslowsky, L. J., Mow, V. C. The relationship of acromial architecture to rotator cuff disease. Clin Sports Med. 10 (4), 823-838 (1991).
  52. Chimenti, R. L., Cychosz, C. C., Hall, M. M., Phisitkul, P. Current Concepts Review Update Insertional Achilles Tendinopathy. Foot Ankle Int. 38 (10), 1160-1169 (2017).
  53. Nicholson, C. W., Berlet, G. C., Lee, T. H. Prediction of the Success of Nonoperative Treatment of Insertional Achilles Tendinosis Based on MRI. Foot Ankle Int. 28 (4), 472-477 (2007).
  54. Lohrer, H., David, S., Nauck, T. Surgical treatment for achilles tendinopathy – a systematic review. BMC musculoskelet disord. 17 (1), 207 (2016).
  55. McGarvey, W. C., Palumbo, R. C., Baxter, D. E., Leibman, B. D. Insertional Achilles Tendinosis: Surgical Treatment Through a Central Tendon Splitting Approach. Foot Ankle Int. 23 (1), 19-25 (2002).
  56. Maffulli, N., et al. Surgery for chronic Achilles tendinopathy produces worse results in women. Disabil Rehabil. 30 (20-22), 1714-1720 (1714).
  57. Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology – a perspective. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 262-277 (2020).
  58. Dyment, N. A., et al. A brief history of tendon and ligament bioreactors: Impact and future prospects. J Orthop Res. 38 (11), 2318-2330 (2020).
  59. Screen, H. R. C., Berk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. F. Tendon Functional Extracellular Matrix. J Orthop Res. 33 (6), 793-799 (2015).
  60. Theobald, P., et al. The functional anatomy of Kager’s fat pad in relation to retrocalcaneal problems and other hindfoot disorders. J Anat. 208 (1), 91-97 (2006).
  61. Ghazzawi, A., Theobald, P., Pugh, N., Byrne, C., Nokes, L. Quantifying the motion of Kager’s fat pad. J Orthop Res. 27 (11), 1457-1460 (2009).
  62. Malagelada, F., et al. Pressure changes in the Kager fat pad at the extremes of ankle motion suggest a potential role in Achilles tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 28 (1), 148-154 (2020).
  63. Shaw, H. M., Benjamin, M. Structure-function relationships of entheses in relation to mechanical load and exercise. Scand J Med Sci Sports. 17 (4), 303-315 (2007).
  64. Soslowsky, L. J., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: role of extrinsic and overuse factors. Ann Biomed Eng. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  65. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. J Shoulder Elbow Surg. 7 (4), 375-380 (1998).
  66. Croen, B. J., et al. Chronic subacromial impingement leads to supraspinatus muscle functional and morphological changes: Evaluation in a murine model. J Orthop Res. 39 (10), 2243-2251 (2021).
  67. Andarawis-Puri, N., Flatow, E. L. Tendon fatigue in response to mechanical loading. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 106-114 (2011).
  68. Gains, C. C., Giannapoulos, A., Zamboulis, D. E., Lopez-Tremoleda, J., Screen, H. R. C. Development and application of a novel in vivo overload model of the Achilles tendon in rat. J Biomech. 151, 111546 (2023).
  69. Williamson, P. M., et al. A passive ankle dorsiflexion testing system to assess mechanobiological and structural response to cyclic loading in rat Achilles tendon. J Biomech. 156, 111664 (2023).
  70. Pedaprolu, K., Szczesny, S. E. A Novel, Open-Source, Low-Cost Bioreactor for Load-Controlled Cyclic Loading of Tendon Explants. J Biomech Eng. 144 (8), 084505 (2022).
  71. Orishimo, K. F., et al. Effect of Knee Flexion Angle on Achilles Tendon Force and Ankle Joint Plantarflexion Moment During Passive Dorsiflexion. J Foot Ankle Surg. 47 (1), 34-39 (2008).
  72. Liu, C. L., et al. Influence of different knee and ankle ranges of motion on the elasticity of triceps surae muscles, Achilles tendon, and plantar fascia. Sci Rep. 10 (1), 6643 (2020).
  73. Cruz-Montecinos, C., et al. Soleus muscle and Achilles tendon compressive stiffness is related to knee and ankle positioning. J Electromyogr Kinesiol. 66, 102698 (2022).
  74. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Lose-dose administration of dexamethasone is beneficial in preventing secondary tendon damage in a stress-deprived joint injury explant model. J Orthop Res. 38 (1), 139-149 (2020).
  75. Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biol. 89, 11-26 (2020).
  76. Yabusaki, K., et al. A Novel Quantitative Approach for Eliminating Sample-To-Sample Variation Using a Hue Saturation Value Analysis Program. PloS one. 9 (3), e89627 (2014).
  77. Gao, J., Messner, K., Ralphs, J. R., Benjamin, M. An immunohistochemical study of enthesis development in the medial collateral ligament of the rat knee joint. Anat Embryol. 194 (4), 399-406 (1996).
  78. Han, S. K., Wouters, W. A. J., Clark, A., Herzog, W. Mechanically induced calcium signaling in chondrocytes in situ. J Orthop Res. 30 (3), 475-481 (2012).
  79. Han, W., et al. Impact of cellular microenvironment and mechanical perturbation on calcium signalling in meniscus fibrochondrocytes. Eur Cell Mater. 27, 321-331 (2014).
  80. Rossetti, L., et al. The microstructure and micromechanics of the tendon-bone insertion. Nat Mater. 16 (6), 664-670 (2017).
  81. Sartori, J., Köhring, S., Witte, H., Fischer, M. S., Löffler, M. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  82. Eliasberg, C. D., et al. Identification of Inflammatory Mediators in Tendinopathy Using a Murine Subacromial Impingement Model. J Orthop Res. 37 (12), 2575-2582 (2019).
  83. Zhang, Y., et al. Expression of alarmins in a murine rotator cuff tendinopathy model. J Orthop Res. 38 (11), 2513-2520 (2020).
  84. Zhang, X., et al. Assessment of Mitochondrial Dysfunction in a Murine Model of Supraspinatus Tendinopathy. J Bone Joint Surg. Am. 103 (2), 174-183 (2021).
  85. Liu, Y., et al. The role of Indian Hedgehog Signaling in tendon response to subacromial impingement: evaluation using a mouse model. Am J Sports Med. 50 (2), 362-370 (2022).
  86. Wang, T., et al. Load-induced regulation of tendon homeostasis by SPARC, a genetic predisposition factor for tendon and ligament injuries. Sci Transl Med. 13 (582), eabe5738 (2021).
  87. Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nat Biomed Eng. 5 (12), 1457-1471 (2021).
  88. Jones, D. L., et al. Mechanoepigenetic regulation of extracellular matrix homeostasis via Yap and Taz. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (22), e2211947120 (2023).
  89. Connizzo, B. K., Grodzinsky, A. J. Release of pro-inflammatory cytokines from muscle and bone causes tenocyte death in a novel rotator cuff in vitro explant culture model. Connect Tissue Res. 59 (5), 423-436 (2018).
  90. Rees, S. G., et al. Catabolism of aggrecan, decorin and biglycan in tendon. Biochem J. 350 (Pt 1), 181-188 (2000).
  91. Samiric, T., Ilic, M. Z., Handley, C. J. Large aggregating and small leucine-rich proteoglycans are degraded by different pathways and at different rates in tendon. Eur J Biochem. 271 (17), 3612-3620 (2004).
  92. Rees, S. G., Curtis, C. L., Dent, C. M., Caterson, B. Catabolism of aggrecan proteoglycan aggregate components in short-term explant cultures of tendon. Matrix Biol. 24 (3), 219-231 (2005).
  93. Taye, N., Karoulias, S. Z., Hubmacher, D. The "other" 15-40%: The Role of Non-Collagenous Extracellular Matrix Proteins and Minor Collagens in Tendon. J Orthop Res. 38 (1), 23-35 (2020).
  94. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L. The development of the pressure-bearing tendon of the bullfrog, Rana catesbeiana. Anat Embryol. 200 (1), 55-64 (1999).
  95. Carvalho, H. F., Felisbino, S. L., Covizi, D. Z., Della Colleta, H. H., Gomes, L. Structure and proteoglycan composition of specialized regions of the elastic tendon of the chicken wing. Cell Tissue Res. 300 (3), 435-446 (2000).
  96. van Sterkenburg, M. N., Kerkhoffs, G. M., Kleipool, R. P., Niek van Dijk, C. The plantaris tendon and a potential role in mid-portion Achilles tendinopathy: an observational anatomical study. J Anat. 218 (3), 336-341 (2011).
  97. Lee, A. H., Elliott, D. M. Comparative multi-scale hierarchical structure of the tail, plantaris, and Achilles tendons in the rat. J Anat. 234 (2), 252-262 (2019).
  98. Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-Scale Loading and Damage Mechanisms of Plantaris and Rat Tail Tendons. J Orthop Res. 37 (8), 1827-1837 (2019).
  99. Fan, H. M., Shrestha, L., Guo, Y., Tao, H. R., Sun, Y. L. The twisted structure of the rat Achilles tendon. J Anat. 239 (5), 1134-1140 (2021).
  100. Cutlip, R. G., Stauber, W. T., Willison, R. H., McIntosh, T. A., Means, K. H. Dynamometer for rat plantar flexor muscles in vivo. Med Biol Eng Comput. 35 (5), 540-543 (1997).
  101. Rijkelijkhuizen, J. M., Baan, G. C., de Haan, A., de Ruiter, C. J., Huijing, P. A. Extramuscular myofascial force transmission for in situ rat medial gastrocnemius and plantaris muscles in progressive stages of dissection. J Exp Biol. 208 (Pt 1), 129-140 (2005).
  102. Saxena, A., Bareither, D. Magnetic Resonance and Cadaveric Findings of the Incidence of Plantaris Tendon. Foot Ankle Int. 21 (7), 570-572 (2000).
  103. dos Santos, M. A., Bertelli, J. A., Kechele, P. R., Duarte, H. Anatomical study of the plantaris tendon: reliability as a tendo-osseous graft. Surg Radiol Anat. 31 (1), 59-61 (2009).
  104. Sartori, J., Köhring, S., Bruns, S., Moosmann, J., Hammel, J. U. Gaining Insight into the Deformation of Achilles Tendon Entheses in Mice. Adv Eng Mater. 23 (11), 2100085 (2021).

Tags

Keywords: Murine Hind LimbExplant ModelMechanobiologyAchilles Tendon ImpingementMultiaxial Mechanical StrainFibrocartilageTendinopathyIn Vitro ModelIn Vivo ModelExtracellular MatrixGlycosaminoglycan (GAG)Collagen Network
check_url/65801?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image