Modèle d’explant murin d’un membre postérieur pour l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille
Summary
Nous présentons une plate-forme expérimentale personnalisée et un protocole de culture tissulaire qui recrée le changement fibrocartilagineux induit par le conflit de l’insertion du tendon d’Achille dans les explants murins des membres postérieurs avec une viabilité cellulaire soutenue, fournissant un modèle adapté à l’exploration de la mécanobiologie du conflit tendonineux.
Abstract
L’impact tendineux sur l’os génère un environnement de déformation mécanique multiaxiale avec une déformation de compression transversale nettement élevée, ce qui provoque un phénotype de fibrocartilage localisé caractérisé par l’accumulation d’une matrice riche en glycosaminoglycanes (GAG) et le remodelage du réseau de collagène. Alors que le fibrocartilage est une caractéristique normale dans les régions touchées des tendons sains, le dépôt excessif de GAG et la désorganisation du réseau de collagène sont des caractéristiques caractéristiques de la tendinopathie. En conséquence, le conflit est cliniquement reconnu comme un facteur extrinsèque important dans l’initiation et la progression de la tendinopathie. Néanmoins, la mécanobiologie sous-jacente au conflit tendineux reste peu étudiée. Des efforts antérieurs pour élucider la réponse cellulaire au conflit tendineux ont appliqué une compression uniaxiale aux cellules et excisé des explants tendineux in vitro. Cependant, les cellules isolées n’ont pas d’environnement extracellulaire tridimensionnel crucial pour la mécanoréponse, et les études in vitro et les études d’explants excisés ne parviennent pas à récapituler l’environnement de déformation multiaxiale généré par le conflit tendineux in vivo, qui dépend des caractéristiques anatomiques de la région touchée. De plus, les modèles in vivo de conflit tendineux manquent de contrôle sur l’environnement de déformation mécanique. Pour pallier ces limitations, nous présentons un nouveau modèle d’explant de membre postérieur murin adapté à l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille. Ce modèle maintient le tendon d’Achille in situ pour préserver l’anatomie locale et reproduit l’environnement de déformation multiaxiale généré par l’impact de l’insertion du tendon d’Achille sur le calcanéum lors d’une dorsiflexion passive de la cheville tout en conservant les cellules dans leur environnement d’origine. Nous décrivons un protocole de culture tissulaire faisant partie intégrante de ce modèle et présentons des données établissant la viabilité durable de l’explant sur 7 jours. Les résultats représentatifs démontrent une amélioration de la coloration histologique des GAG et une diminution de l’alignement des fibres de collagène secondaire au conflit, suggérant une formation élevée de fibrocartilage. Ce modèle peut facilement être adapté pour étudier différents régimes de charge mécanique et permet la manipulation de voies moléculaires d’intérêt pour identifier les mécanismes médiant le changement phénotypique dans le tendon d’Achille en réponse au conflit.
Introduction
Une multitude de tendons, y compris le tendon d’Achille et les tendons de la coiffe des rotateurs, subissent un conflit osseux dû à un positionnement anatomique normal1,2,3,4. Le conflit tendineux génère une contrainte de compression dirigée transversalement à l’axe longitudinal de la fibre5,6,7. Les régions de conflit tendineux présentent un phénotype de fibrocartilage unique dans lequel des cellules rondes rétrécies (fibrochondrocytes) sont intégrées dans un réseau de collagène désorganisé avec une teneur en glycosaminoglycane (GAG) nettement accrue2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Des études antérieures suggèrent que l’environnement mécanique disparate produit par le conflit tendineux soutient cette matrice riche en GAG en conduisant au dépôt de protéoglycanes agrégeants de grande taille, notamment l’aggrécan, bien que les mécanismes sous-jacents ne soient pas clairs1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Alors que le fibrocartilage est une caractéristique normale dans les régions touchées des tendons sains, le métabolisme aberrant des protéoglycanes associé à une formation excessive de fibrocartilage est une caractéristique caractéristique de la tendinopathie, une maladie courante et débilitante qui émerge de manière disproportionnée dans les tendons chroniquement touchés1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. En conséquence, le conflit tendineux est cliniquement reconnu comme un facteur extrinsèque important à l’origine de plusieurs des tendinopathies les plus courantes, notamment la maladie de la coiffe des rotateurs et la tendinopathie d’Achille insertionnelle (IAT)50,51,52. À l’heure actuelle, le traitement de la tendinopathie est inefficace. Par exemple, environ 47 % des patients atteints d’IAT nécessitent une intervention chirurgicale après l’échec d’une prise en charge conservatrice, avec des résultats postopératoires variables53,54,55,56. Malgré la relation apparente entre le conflit et la tendinopathie, les mécanismes mécanobiologiques par lesquels les cellules du tendon touché perçoivent et réagissent à leur environnement mécanique sont mal décrits, ce qui obscurcit la compréhension de la pathogenèse de la tendinopathie et entraîne un traitement inadéquat.
Les modèles d’explants sont des outils utiles dans l’étude de la mécanobiologie tendineuse57,58. Comme première étape vers la compréhension de la mécanobiologie du conflit tendonin, plusieurs études antérieures ont exploré la réponse cellulaire suite à l’application d’une compression uniaxiale simple à des cellules ou d’explants tendineux excisés 27,29,30,31,32,33,34,39. Cependant, les cellules in vitro manquent de matrices extracellulaires et péricellulaires qui facilitent le transfert de souches, séquestrent d’importants facteurs de croissance et cytokines libérés par la déformation mécanique, et fournissent un substrat pour les complexes d’adhésion focaux qui jouent un rôle dans la mécanotransduction57,59. De plus, les études in vitro et excisées ne parviennent pas à récapituler l’environnement de déformation mécanique multiaxiale généré par le conflit tendineux in vivo, qui dépend des caractéristiques anatomiques de la région touchée 5,6. Dans le contexte de l’insertion du tendon d’Achille touché, cela inclut les tissus environnants tels que la bourse rétrocalcanéenne et le coussinet adipeux de Kager 60,61,62,63. À l’inverse, les modèles in vivo de conflit tendineux 25,28,36,37,38,64,65,66 permettent un contrôle minimal de l’amplitude et de la fréquence de la charge appliquée directement au tendon, ce qui est une limitation bien connue des modèles in vivo pour l’étude de la mécanobiologie tendineuse57,58,67,68,69,70. Compte tenu des difficultés rencontrées dans la mesure de la déformation des tendons in vivo, l’environnement de déformation interne généré dans ces modèles est souvent mal caractérisé.
Dans ce manuscrit, nous présentons une plate-forme expérimentale personnalisée qui recrée l’empiètement de l’insertion du tendon d’Achille sur le calcanéum dans des explants entiers de membres postérieurs murins qui, lorsqu’elle est associée à ce protocole de culture tissulaire, maintient la viabilité pendant 7 jours en culture d’explants et permet d’étudier les séquelles biologiques du conflit tendineux. La plate-forme est construite sur une base d’acide polylactique (PLA) imprimée en 3D qui constitue la base de la fixation des poignées et de l’insert de réduction de volume PLA imprimé en 3D. Les poignées sont utilisées pour serrer la partie supérieure de la jambe et du genou à proximité de la jonction myotendineuse d’Achille avec la face caudale du membre postérieur tournée vers le haut, ce qui permet d’imager le tendon d’Achille d’en haut à l’aide d’une sonde à ultrasons ou d’un microscope inversé (Figure 1A). L’insert de réduction de volume glisse le long d’un rail sur la base et réduit le volume requis de milieux de culture tissulaire. Une ligne tressée enroulée autour de la patte arrière est acheminée hors de la plate-forme à l’aide de la conception de base et d’un clip PLA imprimé en 3D. En tirant sur la corde, la patte arrière est fléchie dorsalement et l’insertion du tendon d’Achille est heurtée contre le calcanéum, ce qui entraîne une contrainte de compression transversale élevée 5,6 (Figure 1A). La plate-forme est contenue dans un bain acrylique qui maintient les explants des membres postérieurs immergés dans des milieux de culture tissulaire. La fixation de la corde tendue à l’extérieur de la baignoire avec du ruban adhésif maintient la dorsiflexion de la cheville pour produire un conflit statique de l’insertion du tendon d’Achille. Les fichiers CAO pour les composants imprimés en 3D sont fournis en plusieurs formats (fichier supplémentaire 1), ce qui permet de les importer dans une gamme de logiciels de CAO commerciaux et gratuits, open-source, pour les modifier en fonction des besoins expérimentaux. Si l’accès aux imprimantes 3D n’est pas disponible pour la fabrication, les fichiers CAO peuvent être fournis aux services d’impression 3D en ligne qui imprimeront et expédieront les pièces à faible coût.
Il est important de noter que le complexe musculo-tendineux triceps surae-Achille s’étend à la fois sur les articulations du genou et de la cheville 71,72,73. Par conséquent, la tension de traction dans le tendon d’Achille est influencée par la flexion du genou. L’extension du genou met le tendon d’Achille sous tension, tandis que la flexion du genou réduit la tension. En étendant d’abord le genou, puis en fléchissant passivement la cheville, les contraintes de compression au niveau de l’insertion heurtée peuvent être superposées aux contraintes de traction. Inversement, en fléchissant passivement la cheville avec le genou fléchi, la tension de traction est réduite et la contrainte de compression persiste. Le protocole actuel explore trois de ces conditions. 1) Pour les conflits statiques, le pied est fléchi dorsivement à < 110° par rapport au tibia pour empiéter sur l’insertion, le genou fléchi pour réduire la tension. 2) Pour le groupe de tension de base, la cheville est étendue au-dessus de 145° de dorsiflexion avec le genou étendu, générant principalement une contrainte de traction à l’insertion. 3) Pour le groupe non chargé, les explants sont cultivés dans une boîte de Pétri avec le genou et la cheville en position neutre en l’absence de charge appliquée à l’extérieur. Les angles mentionnés ci-dessus sont mesurés photographiquement par rapport à un système de coordonnées où le pied et le tibia sont parallèles à un angle de 180° et perpendiculaires à un angle de 90°.
Les étapes clés du protocole comprennent 1) la dissection des explants des membres postérieurs et l’ablation soigneuse de la peau et du tendon plantaire ; 2) culture d’explants après un prétraitement à la dexaméthasone de 48 h ; 3) la coupe des tissus et la coloration histologique ; et 4) l’analyse d’images en couleur pour évaluer la formation du fibrocartilage. Après dissection, chaque explant de membre postérieur est prétraité pendant 48 h dans un milieu de culture complété par de la dexaméthasone74. Les membres controlatéraux de chaque souris sont assignés à des groupes expérimentaux distincts pour une comparaison par paires, ce qui aide à contrôler la variabilité biologique. Après le prétraitement, les explants sont positionnés dans des plates-formes comme décrit ci-dessus et cultivés pendant 7 jours supplémentaires (Figure 1B). Des comparaisons supplémentaires sont faites avec un groupe prétraité (jour 0) dans lequel les explants sont retirés immédiatement après le prétraitement de 48 h.
Après la culture de l’explantation, les membres postérieurs sont coupés, le formol fixé, décalcifié et noyé dans de la paraffine. La coupe en série en orientation sagittale permet de visualiser le tendon d’Achille de la jonction myotendineuse à l’insertion calcanéenne tout en permettant de suivre la profondeur de la section à travers l’ensemble du tendon. Le marquage dUTP X-nick médié par la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) est utilisé pour visualiser les dommages à l’ADN secondaires à l’apoptose et évaluer la viabilité. L’histologie du bleu de toluidine et l’analyse personnalisée de l’image couleur sont effectuées pour quantifier les changements dans la coloration GAG. Des coupes de tissus colorés au bleu de toluidine sont ensuite utilisées pour l’imagerie SHG afin de caractériser les altérations de l’organisation des fibres de collage (Figure 1B).
Les résultats représentatifs fournis suggèrent une altération de la coloration histologique de la matrice riche en GAG et une désorganisation du réseau de collagène extracellulaire générée par 7 jours de conflit statique dans le modèle. Ce modèle peut être utilisé pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents au changement fibrocartilagineux induit par l’impact.
Protocol
Representative Results
Discussion
La plate-forme expérimentale d’explants de membres postérieurs murins associée au protocole de culture tissulaire décrit dans cette étude fournit un modèle approprié pour étudier la mécanobiologie de la formation de fibrocartilage induite par le conflit à l’insertion du tendon d’Achille. L’utilité de ce modèle d’explant est démontrée par les résultats représentatifs, qui indiquent un maintien de la viabilité cellulaire concomitant à un changement significatif et spatialement hétérogène de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants du soutien et de l’aide fournis par Jeff Fox et Vidya Venkatramani du centre d’histologie, de biochimie et d’imagerie moléculaire (HBMI) du Centre de recherche musculo-squelettique de l’Université de Rochester, financé en partie par P30AR06965. De plus, les auteurs tiennent à remercier le Centre de microscopie optique et de nanoscopie (CALMN) du Centre médical de l’Université de Rochester pour son aide en matière de microscopie multiphotonique. Cette étude a été financée par R01 AR070765 et R01 AR070765-04S1, ainsi que par 1R35GM147054 et 1R01AR082349.
Materials
| Absorbent underpads | VWR | 82020-845 | For benchtop dissection |
| Acrylic bath | Source One | X001G46CB1 | Contains the explant platform submerged in culture media |
| Autoclave bin | Thermo Scientific | 13-361-20 | Used as secondary containment, holds two platforms |
| Base | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
| Braided line | KastKing | 30lb test | Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion |
| Clip | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-541-034 | Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm |
| Cytoseal XYL | VWR | 8312-4 | Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections |
| Dexamethasone | MP Biomedical LLC | 194561 | CAS#50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous | Invitrogen by ThermoFisher | D12345 | CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions |
| Double-sided tape | Scotch Brand | 34-8724-5195-9 | To attach sandpaper to Grip platens |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) | Gibco by ThermoFisher | 11965092 | high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | Thermo Scientific Chemicals | J15700.A1 | CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation |
| Ethanol, 200 proof | Thermo Scientific | T038181000 | CAS#64-17-5, 1 L supply |
| Foam biopsy pads | Leica | 3801000 | Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification |
| Forceps, #SS Standard Inox | Dumont | 11203-23 | Straight, smooth, fine tips |
| Forceps, Micro-Adson 4.75" | Fisherbrand | 13-820-073 | Straight, fine tips with serrated teeth |
| Garnet Sandpaper, 50-D Grit | Norton | M600060 01518 | Or other coarse grit sandpaper |
| Glacial acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution |
| Grips | ADMET | GV-100NT-A4 | Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included |
| Histobond Adhesive Microscope Slides | VWR | 16005-108 | Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols |
| In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Labeling tape | Fisherbrand | 15-959 | Or any other labeling tape of preference |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | CAS#50-81-7, for culture media formulation |
| Neutral buffered formalin, 10% | Leica | 3800600 | For sample fixation, 5 gallon supply |
| Nunc petri dishes | Sigma-Aldrich | P7741-1CS | 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Gibco by ThermoFisher | 15140122 | Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration |
| Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament | Hatchbox | – | Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice. |
| Processing cassettes | Leica | 3802631 | For fixation, decalcification and paraffin embedding |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen by ThermoFisher | P36931 | Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL |
| Proteinase K | Fisher BioReagents | BP1700-50 | CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol |
| Scissors, Fine | FST | 14094-11 | Straight, sharp |
| Slide Staining Set, 12-place | Mercedes Scientific | MER 1011 | Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology |
| Sodium acetate, anhydrous | Thermo Scientific Chemicals | A1318430 | CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology |
| Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades | VWR | 25608-964 | For paraffin sectioning |
| Toluidine Blue O | Thermo Scientific Chemicals | 348601000 | CAS#92-31-9 |
| Volume Reduction Insert | – | – | 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files |
| Xylenes | Leica | 3803665 | 4 gallon supply for histological staining |
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