Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles

Summary

Presentamos una plataforma experimental personalizada y un protocolo de cultivo de tejidos que recrea el cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles en explantes de extremidades posteriores murinas con viabilidad celular sostenida, proporcionando un modelo adecuado para explorar la mecanobiología del pinzamiento tendinoso.

Abstract

El pinzamiento tendinoso sobre el hueso genera un ambiente de deformación mecánica multiaxial con una deformación compresiva transversal marcadamente elevada, que provoca un fenotipo de fibrocartílago localizado caracterizado por la acumulación de matriz rica en glicosaminoglicanos (GAG) y la remodelación de la red de colágeno. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el exceso de depósito de GAG y la desorganización de la red de colágeno son características distintivas de la tendinopatía. En consecuencia, el pinzamiento se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante en el inicio y la progresión de la tendinopatía. Sin embargo, la mecanobiología que subyace al pinzamiento del tendón sigue siendo poco estudiada. Los esfuerzos anteriores para dilucidar la respuesta celular al pinzamiento del tendón han aplicado compresión uniaxial a las células y extirpado explantes de tendones in vitro. Sin embargo, las células aisladas carecen de un entorno extracelular tridimensional crucial para la mecanorespuesta, y tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el entorno de deformación multiaxial generado por el pinzamiento del tendón in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada. Además, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso carecen de control sobre el entorno de deformación mecánica. Para superar estas limitaciones, presentamos un novedoso modelo de explante murino de extremidad posterior adecuado para estudiar la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles. Este modelo mantiene el tendón de Aquiles in situ para preservar la anatomía local y reproduce el entorno de tensión multiaxial generado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo durante la dorsiflexión del tobillo aplicada pasivamente, al tiempo que retiene las células dentro de su entorno nativo. Describimos un protocolo de cultivo de tejidos integral para este modelo y presentamos datos que establecen la viabilidad sostenida del explante durante 7 días. Los resultados representativos demuestran un aumento de la tinción histológica de GAG y una disminución de la alineación de las fibras de colágeno secundaria al pinzamiento, lo que sugiere una formación elevada de fibrocartílago. Este modelo se puede adaptar fácilmente para investigar diferentes regímenes de carga mecánica y permite la manipulación de vías moleculares de interés para identificar mecanismos que median el cambio fenotípico en el tendón de Aquiles en respuesta al pinzamiento.

Introduction

Una multitud de tendones, incluidos el tendón de Aquiles y los tendones del manguito rotador, experimentan pinzamiento óseo debido a la posición anatómica normal^1,2,3,4. El pinzamiento del tendón genera una tensión compresiva dirigida transversalmente al eje longitudinal de la fibra^5,6,7. Las regiones de pinzamiento del tendón demuestran un fenotipo único de fibrocartílago en el que las células redondas y encogidas (fibrocondrocitos) están incrustadas dentro de una red de colágeno desorganizada con un contenido marcadamente mayor de glicosaminoglicanos (GAG)^{2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}. Estudios anteriores sugieren que el entorno mecánico dispar producido por el pinzamiento del tendón sostiene esta matriz rica en GAG al impulsar la deposición de grandes proteoglicanos agregantes, sobre todo agrecano, aunque los mecanismos subyacentes no están claros^{1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39}. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el metabolismo aberrante de los proteoglicanos asociado con la formación excesiva de fibrocartílago es una característica distintiva de la tendinopatía, una enfermedad común y debilitante que surge de manera desproporcionada en los tendones con afectación crónica^{1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49}. En consecuencia, el pinzamiento del tendón se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante que impulsa varias de las tendinopatías más comunes, incluida la enfermedad del manguito rotador y la tendinopatía insercional del tendón de Aquiles (IAT)^50,51,52. En la actualidad, el tratamiento de la tendinopatía es ineficiente. Por ejemplo, aproximadamente el 47% de los pacientes con TAI requieren intervención quirúrgica después de un tratamiento conservador fallido, con resultados postoperatorios variables^53,54,55,56. A pesar de la aparente relación entre el pinzamiento y la tendinopatía, los mecanismos mecanobiológicos por los cuales las células del tendón pinzado sienten y responden a su entorno mecánico están mal descritos, lo que oscurece la comprensión de la patogénesis de la tendinopatía y da lugar a un tratamiento inadecuado.

Los modelos de explantes son herramientas útiles en el estudio de la mecanobiología tendinosa^57,58. Como primer paso hacia la comprensión de la mecanobiología del pinzamiento tendinoso, varios estudios previos han explorado la respuesta celular tras la aplicación de la compresión uniaxial simple a las células o explantes tendinosos extirpados 27,29,30,31,32,33,34,39. Sin embargo, las células in vitro carecen de matrices extracelulares y pericelulares que faciliten la transferencia de cepas, secuestren importantes factores de crecimiento y citocinas liberadas por deformación mecánica, y proporcionen sustrato para complejos de adhesión focal que desempeñan un papel en la mecanotransducción^57,59. Además, tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el ambiente de deformación mecánica multiaxial generado por el pinzamiento tendinoso in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada ^5,6. En el contexto de la inserción del tendón de Aquiles afectado, esto incluye los tejidos circundantes como la bolsa retrocalcánea y la almohadilla de grasa de Kager 60,61,62,63. Por el contrario, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso 25,28,36,37,38,64,65,66 permiten un control mínimo sobre la magnitud y frecuencia de la carga aplicada directamente al tendón, lo cual es una limitación bien reconocida de los modelos in vivo para el estudio de la mecanobiología del tendón ^57,58,67,68,69,70. Dados los desafíos en la medición de la deformación tendinosa in vivo, el entorno de deformación interna generado dentro de estos modelos a menudo está mal caracterizado.

En este manuscrito, presentamos una plataforma experimental personalizada que recrea el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo dentro de explantes de extremidades posteriores murinas enteras que, cuando se combina con este protocolo de cultivo de tejidos, mantiene la viabilidad durante 7 días en cultivo de explantes y permite el estudio de las secuelas biológicas del pinzamiento del tendón. La plataforma está construida sobre una base de ácido poliláctico (PLA) impresa en 3D que proporciona la base para la fijación de las empuñaduras y el inserto de reducción de volumen de PLA impreso en 3D. Las empuñaduras se utilizan para sujetar la parte superior de la pierna y la rodilla proximales a la unión miotendinosa del tendón de Aquiles con la cara caudal de la extremidad posterior hacia arriba, lo que permite obtener imágenes del tendón de Aquiles desde arriba utilizando una sonda de ultrasonido o un microscopio invertido (Figura 1A). El inserto de reducción de volumen se desliza a lo largo de una pista en la base y reduce el volumen requerido de medios de cultivo de tejidos. Una línea trenzada envuelta alrededor de la pata trasera se enruta fuera de la plataforma utilizando el diseño de la base y un clip de PLA impreso en 3D. Al tirar de la cuerda, la pata trasera se flexiona dorsal y la inserción del tendón de Aquiles se incita contra el calcáneo, lo que resulta en una tensión compresiva transversal elevada ^5,6 (Figura 1A). La plataforma está contenida dentro de un baño acrílico que mantiene los explantes de la extremidad posterior sumergidos en medios de cultivo de tejidos. Asegurar la cuerda tensa al exterior de la bañera con cinta adhesiva mantiene la dorsiflexión del tobillo para producir un pinzamiento estático de la inserción del tendón de Aquiles. Los archivos CAD para componentes impresos en 3D se proporcionan en múltiples formatos (Archivo complementario 1), lo que permite la importación a una gama de software CAD comercial y gratuito de código abierto para su modificación y adaptación a las necesidades experimentales. Si el acceso a las impresoras 3D no está disponible para la fabricación, se pueden proporcionar archivos CAD a los servicios de impresión 3D en línea que imprimirán y enviarán las piezas a bajo costo.

Es importante destacar que el complejo musculotendinoso tríceps sura-tendón de Aquiles abarca las articulaciones de la rodilla y el tobillo 71,72,73. En consecuencia, la tensión de tracción en el tendón de Aquiles se ve influenciada por la flexión de la rodilla. La extensión de la rodilla pone el tendón de Aquiles bajo tensión, mientras que la flexión de la rodilla reduce la tensión. Al extender primero la rodilla y luego dorsiflexionar pasivamente el tobillo, las tensiones de compresión en la inserción impactada se pueden superponer a las tensiones de tracción. Por el contrario, al flexionar pasivamente el tobillo con la rodilla flexionada, se reduce la tensión de tracción y queda la tensión de compresión. El protocolo actual explora tres de esas condiciones. 1) Para el pinzamiento estático, el pie se flexiona dorsal a < 110° con respecto a la tibia para incidir la inserción, con la rodilla flexionada para reducir la tensión. 2) Para el grupo de tensión basal, el tobillo se extiende por encima de los 145° de dorsiflexión con la rodilla extendida, generando predominantemente tensión de tracción en la inserción. 3) Para el grupo descargado, los explantes se cultivan en una placa de Petri con la rodilla y el tobillo en posiciones neutras en ausencia de carga aplicada externamente. Los ángulos mencionados anteriormente se miden fotográficamente en relación con un sistema de coordenadas en el que el pie y la tibia son paralelos en un ángulo de 180° y perpendiculares en un ángulo de 90°.

Los pasos clave del protocolo incluyen: 1) la disección de los explantes de las extremidades posteriores y la extracción cuidadosa de la piel y el tendón plantar; 2) cultivo de explantes después de un pretratamiento de 48 h con dexametasona; 3) corte de tejido y tinción histológica; y 4) análisis de imágenes en color para evaluar la formación de fibrocartílago. Después de la disección, cada explante de extremidad posterior se pretrata durante 48 h en medios de cultivo suplementados con dexametasona⁷⁴. Las extremidades contralaterales de cada ratón se asignan a grupos experimentales separados para su comparación por pares, lo que ayuda a controlar la variabilidad biológica. Después del pretratamiento, los explantes se colocan en plataformas como se describió anteriormente y se cultivan durante 7 días más (Figura 1B). Se realizan comparaciones adicionales con un grupo pretratado (día 0) en el que los explantes se retiran inmediatamente después del pretratamiento de 48 h.

Después del cultivo del explante, las extremidades posteriores se recortan, se fijan en formol, se descalcifican y se incrustan en parafina. El corte en serie en orientación sagital proporciona una visualización del tendón de Aquiles desde la unión miotendinosa hasta la inserción del calcáneo, al tiempo que permite realizar un seguimiento de la profundidad de la sección a través de todo el tendón. El marcaje X-nick de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) se utiliza para visualizar el daño en el ADN secundario a la apoptosis y evaluar la viabilidad. La histología del azul de toluidina y el análisis de imágenes en color personalizadas se realizan para cuantificar los cambios en la tinción de GAG. A continuación, se utilizan secciones de tejido teñidas con azul de toluidina para la obtención de imágenes de SHG con el fin de caracterizar las alteraciones en la organización de las fibras del collage (Figura 1B).

Los resultados representativos proporcionados sugieren una tinción histológica alterada de la matriz rica en GAG y una desorganización de la red de colágeno extracelular generada por 7 días de pinzamiento estático dentro del modelo. Este modelo se puede utilizar para explorar los mecanismos moleculares que subyacen al cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento.

Protocol

Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. 1. Preparación de medios de cultivo de tejidos Cultivar todos los explantes en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (1x DMEM) con 1% v/v de penicilina-estreptomicina y 200 μM de ácido L-ascórbico en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2. Para el pretratamiento inicial de 48 h, se cultivó cada explante en 70 mL de medio de cultivo suplementado c…

Representative Results

Las imágenes representativas de las secciones de tejido teñidas con TUNEL demuestran núcleos apoptóticos mínimos dentro del cuerpo del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en grupos experimentales (Figura 2A). La cuantificación de estas imágenes proporciona evidencia de que el protocolo de cultivo de tejidos mantiene hasta un 78% de viabilidad en promedio dentro del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en condiciones de carga (<stron…

Discussion

La plataforma experimental de explante de extremidades posteriores murinas, junto con el protocolo de cultivo de tejidos descrito en este estudio, proporciona un modelo adecuado para estudiar la mecanobiología de la formación de fibrocartílago impulsada por el pinzamiento en la inserción del tendón de Aquiles. La utilidad de este modelo de explante queda demostrada por los resultados representativos, que indican el mantenimiento de la viabilidad celular concomitante con un cambio significativo y espacialmente hetero…

Materials

Absorbent underpads	VWR	82020-845	For benchtop dissection
Acrylic bath	Source One	X001G46CB1	Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin	Thermo Scientific	13-361-20	Used as secondary containment, holds two platforms
Base	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line	KastKing	30lb test	Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass	Fisherbrand	12-541-034	Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL	VWR	8312-4	Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone	MP Biomedical LLC	194561	CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Invitrogen by ThermoFisher	D12345	CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape	Scotch Brand	34-8724-5195-9	To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM)	Gibco by ThermoFisher	11965092	high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate	Thermo Scientific Chemicals	J15700.A1	CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof	Thermo Scientific	T038181000	CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads	Leica	3801000	Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox	Dumont	11203-23	Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75"	Fisherbrand	13-820-073	Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit	Norton	M600060 01518	Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38S-500	CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips	ADMET	GV-100NT-A4	Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides	VWR	16005-108	Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red	Roche	12156792910	TUNEL assay
Labeling tape	Fisherbrand	15-959	Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G	CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10%	Leica	3800600	For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes	Sigma-Aldrich	P7741-1CS	100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X)	Gibco by ThermoFisher	15140122	Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament	Hatchbox	–	Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes	Leica	3802631	For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen by ThermoFisher	P36931	Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K	Fisher BioReagents	BP1700-50	CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine	FST	14094-11	Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place	Mercedes Scientific	MER 1011	Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous	Thermo Scientific Chemicals	A1318430	CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades	VWR	25608-964	For paraffin sectioning
Toluidine Blue O	Thermo Scientific Chemicals	348601000	CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert	–	–	3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes	Leica	3803665	4 gallon supply for histological staining