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方法文章

将胰腺导管腺癌重编程为多能性

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DOI：

10.3791/65811

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2024年2月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repair, Institute of Stem Cell Research, The University of Edinburgh, 2King Abdulaziz City for Science and Technology Health Sector (KACST), 3Cancer Early Detection Advanced Research Center, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, 4Brenden-Colson Canter for Pancreatic Care, Oregon Health & Science University, 5Department of Surgery, Oregon Health & Science University, 6Department of Molecular & Medical Genetics, Oregon Health & Science University

本文内容

摘要

本方案描述了将胰腺导管腺癌（PDAC）细胞和正常胰腺导管上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。我们提供了一套优化且详细的逐步操作流程，从慢病毒的制备到建立稳定的iPSC细胞系。

摘要

利用转录因子诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）已几乎可从任何分化的细胞类型中实现，并在科研和临床应用中展现出极高的价值。有趣的是，对胰腺导管腺癌（PDAC）等癌细胞进行iPSC重编程已被证明能够逆转其侵袭性PDAC表型，并克服癌症表观遗传组的异常。由PDAC细胞衍生的iPSCs在分化过程中可重现PDAC从早期胰腺上皮内瘤变（PanIN）前体开始的疾病进展过程，揭示PDAC进展早期发生的分子与细胞变化。因此，PDAC来源的iPSCs可用于模拟PDAC的最早期阶段，从而发现可用于早期检测的诊断标志物。这一点对于PDAC患者尤为重要，因为目前缺乏可靠的PanIN早期阶段生物标志物，导致大多数患者通常在晚期转移阶段才得以确诊。然而，将包括PDAC在内的癌细胞系重编程为多能状态仍面临挑战，过程繁琐且不同细胞系之间的效率差异显著。本文中，我们描述了一种使用双顺反子慢病毒载体从多种人源PDAC细胞系生成iPSCs的更为稳定一致的实验方案。所获得的iPSC细胞系具有良好的稳定性，无需依赖外源性重编程因子表达或诱导药物的持续存在。总体而言，该方案有助于高效生成多种PDAC来源的iPSCs，这对于发现更具特异性和代表性的PDAC早期生物标志物至关重要。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一，由于该疾病早期无明显症状，早期诊断仍然具有挑战性。大多数PDAC患者在确诊时已处于晚期转移阶段，此时可用的治疗选择极为有限1,2。这主要是因为缺乏可用于早期阶段的可靠生物标志物，例如那些可被方便检测到的、释放到血液中的蛋白质类标志物。

胰腺导管腺癌（PDAC）在其进展过程中可很早发生播散，当PDAC局限于胰腺时进行早期癌症检测与较好的预后相关3。然而，仅有不到十分之一的PDAC患者被诊断时处于有利预后阶段，从而能够接受手术切除。即便如此，这些少数可切除肿瘤的患者中，也有很大比例在12个月内出现肿瘤复发4。

在过去五十年中，外科手术技术、患者护理和治疗方式已取得显著进步5,6。然而，接受手术切除的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的5年生存率仅略微提高至17%。尽管如此，这一数据仍优于未接受切除手术的患者，后者生存率几乎未变（0.9%）4,7。化疗是目前唯一可用于PDAC的替代治疗手段。然而，该选择极为有限，因为绝大多数PDAC患者对吉西他滨（Gemcitabine）等化疗药物表现出强烈耐药性7,8。其他药物，如厄洛替尼（Erlotinib），仅适用于具有特定突变的一小部分PDAC患者，而其中大多数患者仍对厄洛替尼耐药9。此外，大多数PDAC患者在接受化疗时伴随的不良副作用是该疗法的另一项不利因素10。近期有前景的策略表明，免疫检查点抑制剂（ICIs）和小分子激酶抑制剂（SMKIs）在治疗PDAC方面可能有效，但这些靶向治疗的持久应答仍仅限于少数患者11,12。总体而言，发现PDAC特异性的早期生物标志物可为早期诊断和治疗开辟新途径。

胰腺导管腺癌（PDAC）起源于胰腺上皮内瘤变（PanIN）癌前病变，这些病变由非侵袭性的胰腺导管上皮细胞增殖所致13,14。尽管PanIN的形成始于KRAS等癌基因的突变，但其向PDAC进展还需要额外的遗传和表观遗传改变。据估计，PanIN经历不同阶段发展为侵袭性PDAC大约需要10年时间13,15,16,17。这一时间窗口为实现PDAC的早期诊断提供了重要机遇。因此，已有大量研究致力于建立肿瘤异种移植动物模型和类器官培养体系以研究PDAC的进展过程18,19,20,21。这些模型在研究PDAC侵袭阶段方面非常有用，但难以模拟从早期PanIN阶段转变的过程。因此，建立能够重现PanIN早期进展过程的实验模型，对于发现早期检测生物标志物具有重要意义。

利用四种转录因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC（OSKM）将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），揭示了细胞可塑性的程度22。癌症细胞的可塑性已有充分记录，将人类癌细胞重编程为iPSCs已被成功用于将细胞重置至其原始状态，消除在癌症进展过程中积累的许多表观遗传损伤23,24,25,26,27,28,29。因此，利用这种重编程策略调控癌细胞身份的可能性在癌症治疗中展现出巨大前景30,31。事实上，我们此前已证明，源自胰腺导管腺癌（PDAC）的iPSCs的分化能够重现PDAC通过早期PanIN阶段的进展过程32。通过鉴定PDAC早期至中期阶段特异的基因和通路，识别出可用于临床早期PDAC诊断的候选生物标志物32,33。然而，使用单个iPSC系发现的生物标志物在大多数PDAC患者中覆盖范围有限32。从其他PDAC患者中生成iPSC系所面临的挑战阻碍了发现更可靠生物标志物的能力。这归因于多种技术因素，包括OSKM递送的异质性，因为仅有少数人类原代PDAC细胞同时含有全部四种因子并成功响应重编程。本文提供了一种详细的实验方案，采用更高效且一致的双慢病毒系统递送OSKM，用于重编程原代PDAC细胞。

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方案

所有实验方案均经俄勒冈健康与科学大学（OHSU）机构审查委员会批准。所有方法均按照相关指南和法规进行。涉及PDX肿瘤的动物实验均在获得OHSU机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准后开展。本方案已在以下细胞中进行测试：来自患者来源的异种移植（PDX）模型的原代PDAC细胞、具有上皮形态的BxPc3细胞系（该细胞系分离自一名61岁女性腺癌患者的胰腺组织）、源自正常人胰腺导管上皮的H6C7永生化上皮细胞系，以及来自健康个体皮肤活检的原代人成纤维细胞。人PDAC样本取自俄勒冈胰腺组织登记研究（IRB00003609）。所有受试者均签署了知情同意书。原代人成纤维细胞由英国爱丁堡RBiomedical公司提供，其皮肤样本来自在英国爱丁堡皇家医院Little France院区接受常规手术的匿名供体，采集过程已获得供体同意并经伦理批准（编号09/MRE00/91）。所有慢病毒相关工作均在二级生物安全研究活动（GM207/16.6）条件下进行，并已获得爱丁堡大学健康与安全部门批准，同时已向苏格兰政府HSE主管机构报备。所有使用人胰腺细胞的重编程实验均在爱丁堡大学生物科学学院伦理委员会批准下进行（参考编号# asoufi-0002）。

1. 慢病毒的制备

  1. 用于慢病毒制备时，准备高质量的包装质粒和表达质粒（无内毒素），浓度为1–2 µg/µL，包括psPAX2、pMDG34，以及两种含有RES的双顺反子载体：pSIN4-EF1a-O2S，由EF-1α启动子驱动表达OCT4和SOX2；pSIN4-CMV-K2M，在CMV增强子/启动子控制下表达KLF4和c-MYC35 （参见 材料表同时准备用作转染对照的 pWPT-GFP 质粒。
  2. 解冻人胚胎肾细胞系（293T），并在GMEM培养基（Glasgow's Minimum Essential Medium）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FCS）、1×非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和1 mM谷氨酰胺（见 材料表37 °C 和 5% CO2.
    注意：建议使用解冻后四代以内的293T细胞。
  3. 在转染前24小时，以每15 cm培养皿300万个细胞的密度接种293T细胞，共需三皿。建议在下午较晚时间（约16:00）接种细胞。
  4. 次日（约16:00），当细胞融合度达到约40%–50%时，为三次转染反应准备以下试剂：
    注意：由于移液误差，务必额外增加 10% 的体积。
    1. 标记三个15 mL塑料管，分别注明相应的慢病毒名称（pSIN4-EF1a-O2S、pSIN4-CMV-K2M和pwPT-GFP对照）。加入1.710 mL低血清培养基（见 材料表) 加入各管中。
    2. 稀释90 µL转染试剂（参见 材料表) 加入1.710 mL低血清培养基中，涡旋混匀2秒，室温孵育5分钟。
    3. 混合包装载体：psPAX2 5.1 µg 和 pMDG 2.4 µg（总计 7.5 µg）。
    4. 将包装载体混合物加入转染培养基（来自步骤 1.4.2）中，涡旋振荡 2 秒。
    5. 向步骤 (1.4.4) 的转染混合物中加入每种重编程载体各 7.5 µg：pSIN4-EF1a-O2S、pSIN4-CMV-K2M 以及 pwPT-GFP 对照，涡旋振荡 2 秒。
      注意：使用表达载体与病毒载体的比例为1:1。
  5. 将转染管在室温下孵育15分钟。
  6. 将步骤（1.4.5）中获得的转染-DNA 混合物逐滴加入培养基中，对 293T 细胞进行每种慢病毒的转染。轻轻晃动培养皿，确保混合物在整个表面均匀分布。
  7. 将转染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 过夜孵育。
    注意：使用针对病毒的废弃物容器，将废弃物放入金属垃圾桶中，用高压灭菌袋双层封装，并准备专用的病毒液体废弃物容器，加入消毒片剂。所有移液器、枪头和离心管均应丢弃至金属垃圾桶中。旧培养基应弃于病毒液体废弃物容器中。避免使用玻璃移液管和玻璃器皿，以防止病毒意外污染。
  8. 转染后14-16小时，将培养基更换为30 mL新鲜的293T培养基。
  9. 将转染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在换液后培养60-72小时。每天观察细胞，并通过GFP荧光检测转染效率。
    注意：理想情况下，转染效率应达到 >通过GFP检测，转染效率应达到90%。对于其他病毒，应观察293T细胞明显的形态学变化，因为细胞在产生病毒颗粒时会趋于变圆。
  10. 将每次病毒转染培养物的培养基收集至50 mL离心管中，于1932 x g离心，去除细胞碎片 g 4 °C 下离心 10 分钟。
  11. 将每种慢病毒上清液通过0.45 µM针头滤器过滤，以去除较小的碎片，并收集至新的50 mL离心管中。
  12. 将每份慢病毒上清液分装为6 mL等份，立即在液氮中速冻。
  13. 将慢病毒分装样品保存于 -80 °C，直至使用前。

2. 重编程慢病毒转导

  1. 解冻原代胰腺导管腺癌（PDAC）细胞，并在完全定义的无血清角质形成细胞培养基（KSFM）中培养，培养基中添加牛垂体提取物（BPE）、人重组表皮生长因子（EGF）（5 ng/mL）和霍乱毒素（50 ng/mL），置于37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）的培养箱中（参见材料表）。
  2. 解冻胰腺鳞状导管腺癌细胞系BxPc3，在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
  3. 解冻胰腺导管上皮细胞H6C7，在添加BPE和EGF（5 ng/mL）的KSFM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
  4. 解冻人成纤维细胞（hFib），在添加10% FCS、1×非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、1 mM谷氨酰胺和0.05 mM（终浓度）β-巯基乙醇的格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
  5. 在慢病毒转导前一天（建议为傍晚），准备6孔板中的两个孔，每孔分别接种100,000个PDAC、BxPc3、H6C7和hFib细胞。其中一个孔用OSKM慢病毒感染，另一孔作为未感染对照。
    注意：每种细胞类型应使用单独的培养板。
  6. 次日下午（约24小时后），确保细胞融合度至少达到70%，再进行下一步慢病毒感染操作。

3. 胰腺导管腺癌的慢病毒转导

  1. 在37 °C病毒培养箱中解冻5 mL每种慢病毒上清液。
  2. 准备两个15 mL离心管，每个管中加入2 mL预热的PDAC培养基。
  3. 向第一个管中加入6 mL每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M和pSIN4-EF1a-O2S）以及12 µL的4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL，参见材料表），混匀。
  4. 向第二个管中加入2 µL的4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL）。
  5. 弃去每个孔中的培养基，并在室温下用PBS洗涤一次。
  6. 将重编程感染液（管1）加入第一个孔中。
  7. 将管2中的混合液加入第二个孔中。此孔作为未感染对照。
  8. 将PDAC细胞置于37 °C、5% CO2, 和5% O2（低氧）培养箱中过夜培养。
  9. 次日下午，弃去两孔中的培养基，并更换为新鲜的PDAC培养基。
  10. 将细胞在37 °C、5% CO2, 和5% O2（低氧）条件下继续培养48 h。

4. BxPc3 细胞的慢病毒转导

  1. 在37 °C病毒培养箱中解冻3 mL每种慢病毒上清液。
  2. 准备两个15 mL离心管，每个管中加入2 mL BxPc3培养基。
  3. 向第一个管中加入3 mL每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M和pSIN4-EF1a-O2S）以及6 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL），混匀。
  4. 向第二个管中加入2 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL）。
  5. 弃去每个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。
  6. 将重编程感染培养基（第1管）加入第一个孔中。
  7. 将第2管的混合液加入第二个孔中，作为未感染对照。
  8. 将感染后的BxPc3细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  9. 次日下午，弃去两孔中的培养基，更换为新鲜的BxPc3培养基。
  10. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育48 h。

5. 慢病毒感染 H6c7 细胞的转导

  1. 在37 °C病毒培养箱中解冻4 mL每种慢病毒上清液。
  2. 准备两个15 mL离心管，每个管中加入2 mL H6c7培养基。
  3. 向第一个管中加入4 mL每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M和pSIN4-EF1a-O2S）以及8 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL），混匀。
  4. 向第二个管中加入2 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL）。
  5. 弃去两个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。
  6. 将重编程感染培养基（第1管）加入第一个孔中。
  7. 将第2管的混合液加入第二个孔中，作为未感染对照组。
  8. 将感染后的H6C7细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  9. 次日下午，弃去两孔中的培养基，更换为新鲜的H6c7培养基。
  10. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育48 h。

6. hFib 细胞的慢病毒转导

  1. 在37 °C病毒培养箱中解冻每种慢病毒上清液各2 mL。
  2. 准备两个15 mL离心管，每管加入2 mL hFib培养基。
  3. 向第一管中加入每种重编程病毒各2 mL（pSIN4-CMV-K2M 和 pSIN4-EF1a-O2S），再加入4 µL 4.5 mg/mL的polybrene（终浓度为4.5 µg/mL），混匀。
  4. 向第二管中加入2 µL 4.5 mg/mL的polybrene（终浓度为4.5 µg/mL），混匀。
  5. 弃去每个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。
  6. 将重编程感染液（第1管）加入第一个孔中。
  7. 将第2管中的混合液加入第二个孔中，作为未感染对照组。
  8. 将感染后的hFib细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  9. 次日下午，弃去两孔中的培养基，更换为新鲜的hFib培养基。
  10. 继续在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞48小时。
    注意：为实现高效的慢病毒转导，需谨慎滴定慢病毒用量， 因为不同细胞类型的适宜用量差异较大。某些细胞类型可能需要多次转导。胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系最多需要三次给药，而BxPc3、H6C7和hFib细胞系仅需一次给药即可完成重编程。

7. iMEF 饲养层细胞的制备

  1. 通过将1%明胶储备液用PBS稀释，配制40 mL 0.2%明胶溶液。
  2. 用2 mL 0.2%明胶溶液覆盖每个孔，对四个6孔板进行包被。
  3. 将包被明胶的孔板置于37 °C、5% CO2条件下孵育至少30分钟。
  4. 吸除多余的明胶溶液，并将孔板置于超净工作台中晾干。
  5. 在37 °C水浴中轻轻摇动，解冻两管（每管约含400万细胞）辐照小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。
    注意：为降低污染风险，操作时应避免水溅至管盖开口附近。用纸巾擦干管壁，并喷洒70%乙醇消毒。
  6. 在组织培养超净台内，将每管解冻后的iMEFs逐滴加入含有10 mL预热hFib培养基的15 mL离心管中，并通过轻柔颠倒混匀。
  7. 在室温下以309 × g离心3分钟，沉淀细胞，弃去上清液。将每管细胞沉淀重悬于12 mL hFib培养基中。
  8. 每孔加入2 mL细胞悬液至明胶包被的6孔板中，通过轻轻多方向摇动孔板使细胞均匀分布。
  9. 将孔板在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
    注意：重编程实验前24小时应制备新鲜的iMEF饲养层细胞板。

8. 将感染的细胞转移至iMEF饲养层

  1. 弃去感染和未感染的PDAC、BxPc3、H6c7和hFib细胞的培养基，在室温下用PBS洗涤每个孔两次。
  2. 向每孔加入0.5 mL胰蛋白酶，使细胞从培养板上解离。将PDAC细胞置于37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）培养箱中孵育15分钟。
  3. 将BxPc3细胞在37 °C和5% CO2条件下孵育5分钟。
  4. 将H6c7和hFib细胞在37 °C和5% CO2条件下孵育4分钟。
  5. 将每孔解离后的细胞悬液转移至相应标记为感染或未感染的15 mL离心管中。
  6. 通过离心收集细胞，具体条件如下：PDAC细胞以300 × g 离心5分钟；BxPc3细胞以120 × g 离心5分钟；H6C7细胞以112 × g 离心4分钟；hFib细胞以161 × g 离心3分钟。所有离心步骤均在室温下进行。
  7. 将每种细胞的沉淀重悬于1 mL相应的培养基中。
  8. 用每种细胞对应的培养基对步骤7中准备的iMEF培养板进行两次洗涤，即：一块板用PDAC培养基洗涤，一块用BxPc3培养基洗涤，一块用H6C7培养基洗涤，另一块用hFib培养基洗涤。
  9. 在iMEF六孔板的五个孔中，每孔接种50,000个感染细胞；在剩余的一个孔中接种50,000个未感染的对照细胞。
    注意：可根据实验优化接种的感染细胞数量，范围为每孔1,000至50,000个细胞。
  10. 将PDAC细胞在37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）条件下过夜孵育。
  11. 将BxPc3、H6C7和hFib细胞在37 °C和5% CO2条件下过夜孵育。
  12. 次日，按如下方法配制重编程培养基：向400 mL改良伊格尔培养基（DMEM）中加入100 mL无血清替代物（终浓度25%）、5 mL 200 mM谷氨酰胺（终浓度1 mM）、5 mL 100倍非必需氨基酸（终浓度100 µM）和1.5 mL β-巯基乙醇（终浓度0.1 mM）。
  13. 将重编程培养基分装为100 mL每份，于4 °C保存最多4周，或于-20 °C长期保存。
  14. 使用前，向一份100 mL重编程培养基中加入100 µL 10 mg/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度10 ng/mL）。
  15. 将重编程培养基在37 °C水浴中预热。
  16. 用预热的重编程培养基洗涤iMEF饲养层上的细胞两次。
    向每孔加入2 mL重编程培养基。
  17. 将重编程培养板转移至37 °C、5% CO2、3% O2（低氧）培养箱中。
    注意：添加重编程培养基的当天记为重编程第1天。
  18. 每天用新鲜的重编程培养基更换培养液，直至出现iPSC克隆。
    注意：通过类似胚胎干细胞（ESC）的形态学特征识别iPSC克隆（即紧凑、边界清晰的克隆，细胞核质比高）。
  19. 每日观察iPSC克隆，待形成足够数量后，以混合方式传代。
    注意：确保iPSC克隆之间不相互接触，以免导致分化并影响其长期稳定性。
  20. 为建立单克隆细胞系，先将iPSC混合群体传代约5次，然后挑选保持ESC样形态的健壮克隆。
  21. 为鉴定完全重编程的iPSC克隆，可进行TRA-160活细胞染色（见材料表），并从iPSC克隆中提取RNA用于基因表达分析。

9. iPSC 克隆的传代

  1. 在传代iPSC集落前24小时，按照步骤7所述准备足够数量的iMEF饲养层培养板。
  2. 用预热的重编程培养基将iMEF饲养层培养板洗涤两次。
  3. 向iMEF培养板的每孔中加入2 mL添加ROCK抑制剂（Y2）（10 µM）的重编程培养基。
  4. 将iMEF培养板置于37 °C、5% CO2、3% O2的培养箱中孵育，直至使用。
  5. 通过将0.5 M EDTA以1:1000比例稀释于PBS中（终浓度为0.5 mM），配制乙二胺四乙酸/磷酸盐缓冲液（EDTA/PBS）溶液。
  6. 将每孔中的重编程培养基更换为0.5 mL EDTA/PBS溶液。
  7. 根据细胞类型，在37 °C、5% CO2、3% O2培养箱中或室温下孵育。BxPc3和PDAC iPSC需在37 °C孵育15分钟，H6C7和hFib iPSC则需在室温孵育5分钟。
  8. 在显微镜下观察iPSC细胞，直至整个集落中的细胞开始均匀地从饲养层上解离。
  9. 将解离后的iPSC细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟。
  10. 用1 mL添加Y2（10 µM）的重编程培养基重悬细胞沉淀。
  11. 将每1 mL iPSC细胞悬液转移至iMEF培养板的三个孔中，接种于iMEF饲养层上。
    注意：分种比例可能因收获的iPSC集落数量不同而有所变化。
  12. 置于37 °C、5% CO2、3% O2的培养箱中孵育。

10. 使用 TRA-1-60 对 iPSC 克隆进行活体染色

  1. 在重编程培养基中配制每孔 0.5 mL、浓度为 4 µg/mL 的 TRA-1-60 抗体。
  2. 弃去重编程培养基，每孔加入 0.5 mL 抗体混合液。在 37 °C、5% CO2、3% O2 的培养箱中孵育 30 分钟。
  3. 用重编程培养基洗涤细胞两次。
  4. 使用 GFP 滤光片，通过细胞成像系统采集荧光图像。
  5. 通过参考阴性对照通道评估图像质量。

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结果

图1展示了来自PDAC、BxPc3、H6C7和hFib细胞的iPSC集落形态的代表性图像。图1中可见，PDAC-iPSC集落在重编程第25天开始形成，到第40天时出现形态更成熟的、具有典型胚胎干细胞样特征的iPSC集落（图1）。同样，BxPc3-iPSC集落在重编程第23天开始出现，并于第35天趋于成熟。H6C7-iPSC的形成过程与PDAC-iPSC相似，从第45天开始逐渐形成稳定集落。hFib-iPSC集落则在重编程第15天即开始形成。

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讨论

为了促进利用iPSC重编程技术研究癌症进展，目前已建立了一种用于重编程胰腺癌细胞的稳健方案。迄今为止，将癌细胞重编程为多能状态已被证明极具挑战性，仅有少数研究成功地从癌细胞中生成了iPSC32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

A.S 和 J.K 感谢癌症研究英国（Cancer Research UK）和俄勒冈健康与科学大学（OHSU）提供的资助（CRUK-OHSU 项目奖 C65925/A26986）。A.S 受英国医学研究理事会（MRC）职业发展奖（MR/N024028/1）支持。A.A 受沙特阿拉伯阿卜杜勒-阿齐兹国王科技城提供的博士奖学金资助（奖学金编号 1078107040）。J.K 受 MRF 新研究者资助（GCNCR1042A）以及奈特 CEDAR 资助（68182-933-000，68182-939-000）支持。我们感谢Keisuke Kaji教授慷慨提供重编程载体pSIN4-EF1a-O2S和pSIN4-CMV-K2M。为了开放获取的目的，作者已对本提交所产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）许可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇（50 mM）Thermo Fisher31350010
Alexa Fluor 488 抗人 TRA-1-60-RBioLegend330613
牛垂体提取物（BPE）Thermo Fisher13028014
BxPc3ATCCCRL-1687
霍乱弧菌来源的霍乱毒素Merck C8052-1MG
大鼠尾胶原，I型溶液Merck C3867
完全配制的定义型K-SFM培养基Thermo Fisher 10744-019
Corning Costar 经组织培养处理的多孔板Merck CLS3516
Corning 注射器滤器Merck CLS431231
Corning 经组织培养处理的培养皿Merck CLS430599
Day Impex Virkon 杀病毒消毒片Thermo Fisher12328667
Dulbecco′s 磷酸盐缓冲液（PBS）Merck D8537
胎牛血清（FCS） Thermo Fisher10270-106
Fugene HD 转染试剂 Promega  E2312
明胶溶液，B型，2% 溶于 H2OMerck G1393-100ML
格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）Merck G5154
人 EGF 重组蛋白Thermo FisherPHG0311
人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF）（154个氨基酸）重组蛋白，PeproTechThermo Fisher100-18B
人胰腺导管上皮细胞系（H6c7）KerafastECA001-FP
iMEF 饲养层细胞 iXcells Biotechnologies10MU-001-1V
角质形成细胞无血清培养基（KSFM） Thermo Fisher17005-042
KnockOut DMEM Thermo Fisher10829018
KnockOut 血清替代物 Thermo Fisher10828028
L-谷氨酰胺（200 mM）Thermo Fisher25030-024
MEM 非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）Thermo Fisher11140050
Millex-HP 0.45 μm 注射器滤器单元（无菌）Merck SLHP033RS
Opti-MEM 减血清培养基 Thermo Fisher31985062
pMDG AddGene187440
聚凝胺（Hexadimethrine bromide） Merck H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M AddGene21164
pSIN4-EF2-O2S AddGene21162
psPAX2AddGene12260
pWPT-GFP AddGene12255
RPMI 1640 培养基（ATCC 改良型）Thermo FisherA1049101
丙酮酸钠Thermo Fisher11360-039
一次性无菌注射器（60 mL） Thermo Fisher15899152
TrypLE Express 酶（1倍浓度），含酚红Thermo Fisher12605036
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher15575020
Y-27632（盐酸二氢盐）STEMCELL Technologies72304

参考文献

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