נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי Ex Vivo
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להוצאת קרום החלון העגול מעצמות הרקתיות של שרקן, ומספק משאב רב ערך למחקרי ex vivo .
Abstract
מתן יעיל וזעיר פולשני של תרופות לאוזן הפנימית הוא אתגר משמעותי. קרום החלון העגול (RWM), בהיותו אחת מנקודות הכניסה הבודדות לאוזן הפנימית, הפך למוקד חקירה חיוני. עם זאת, בשל המורכבות של בידוד RWM, ההבנה שלנו של הפרמקוקינטיקה שלה נותרה מוגבלת. ה-RWM מורכב משלוש שכבות נפרדות: האפיתל החיצוני, שכבת רקמת החיבור האמצעית ושכבת האפיתל הפנימית, שכל אחת מהן בעלת תכונות העברה ייחודיות.
המודלים הנוכחיים לחקר התחבורה ברחבי RWM משתמשים במודלים של בעלי חיים in vivo או מודלים של RWM ex vivo המסתמכים על תרביות תאים או שברי ממברנה. שרקנים משמשים כמודל פרה-קליני מתוקף לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות בתוך האוזן הפנימית והם מודל חייתי חשוב לפיתוח תרגומי של רכבי משלוח לשבלול. במחקר זה, אנו מתארים גישה לנטיעת RWM של שרקן עם עצם השבלול שמסביב לניסויים בהעברת תרופות. שיטה זו מאפשרת שימור של ארכיטקטורת RWM מקורית ועשויה לספק ייצוג מציאותי יותר של חסמי תחבורה מאשר דגמי הספסלים הנוכחיים.
Introduction
סוגים חדשים של טיפולים התפתחו לטיפול בליקוי שמיעה תחושתי-עצבי. תרגומם של טיפולים אלה לאוכלוסיות קליניות מוגבל על ידי נתיבי הובלה בטוחים ויעילים לאוזן הפנימית. השיטות הנוכחיות של העברת in vivo במחקרים בבעלי חיים מסתמכות על fenestration לתוך האוזן הפנימית או דיפוזיה דרך קרום החלון העגול (RWM), מחסום non-osseous המפריד בין חלל האוזן התיכונה לבין השבלול1.
פנסטרציה כירורגית ומיקרו-הזרקה לאוזן הפנימית הן פולשניות ועלולות להוות סיכון לתפקוד השיורי של האוזן הפנימית2. לכן, RWM הוא נתיב חשוב לאספקת תרופות מקומית, ושרקנים הם המודל הפרה-קליני העיקרי של בעלי חיים המשמש לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות מקומיות ברחבי RWM ובאוזן הפנימית לפיתוח תרופות 3,4. למרות שהוא דק יותר מה-RWM האנושי, השרקן RWM חולק מבנה תלת-שכבתי זהה. קוטרו כ-1 מ”מ, עוביו 15-25 מיקרומטר, והוא מורכב משתי שכבות תאי אפיתל המרכיבות שכבת רקמת חיבור5. שכבת האפיתל הפונה לאוזן התיכונה צפופה ומחוברת באמצעות צמתים הדוקים, בעוד שהשכבה הפונה לאוזן הפנימית ולסקלה טימפאני היא בעלת ארכיטקטורה רופפת יותר ואין לה הידבקויות בין-תאיות משמעותיות.
מחקרים פרה-קליניים עכשוויים החוקרים חדירות תרופות בשרקן RWM מסתמכים על זריקות in vivo באוזן התיכונה ולאחר מכן דגימה של נוזל הפרילימפה בתוך האוזן הפנימית, מה שאינו מאפשר את המחקר הספציפי של הובלת RWM 6,7. שברי צמחי RWM שימשו במחקרים פרה-קליניים, אך בשל שבריריותם וגודלם הקטן, הם אינם מתאימים לחקירות שיטתיות ומיקרופלואידיות של הובלת תרופות וכלי רכב הדורשים אטם אטום למים על פני RWM2. קבוצות אחרות השתמשו במודלים במבחנה עם תאי אפיתל אנושיים בתרבית כדי להעריך בקירוב את RWM 8,9,10. עם זאת, רוב המבנים הללו מתמקדים אך ורק בשכבת האפיתל החיצונית ואינם לוכדים את המורכבות של ארכיטקטורת רקמות טבעית. להבנה מפורטת יותר של מנגנוני הובלה ברחבי RWM, נדרשים מחקרים ממוקדים, ex vivo.
במחקר זה, אנו מדגימים את הנטיעה של RWM שרקן עם תמיכה גרמית מסביב כדי לשמור על שלמות הממברנה וממחישים את השימוש בהם בפרדיגמה ניסיונית המיועדת למחקר ספציפי של הובלת RWM של כלי משלוח סמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באספקת תרופות מקומית לאוזן, RWM הוא נתיב המעבר העיקרי של טיפולים להגיע לאוזן הפנימית. יש צורך במודל מדויק ואמין כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ההובלה והחדירות בין רכבי משלוח חדשניים ולפיתוח תרופות. במחקר זה, אנו מראים כי מטע RWM של שרקנים הוא הליך אפשרי ואמין המאפשר חקירות שיטתיות של אינטראקצי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIDCD מס’ 1K08DC020780 ו- 5T32DC000027-33, וקרן רובינשטיין לחקר השמיעה.
Materials
| 1 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 1SD-G1 | |
| 2 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 2SD-G1 | |
| 6 mm Diamond Ball Drill Bit | Anspach | 6D-G1 | |
| ANSPACH EMAX 2 Plus System | Anspach | EMAX2PLUS | Any bone cutting drilling system will work |
| BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe | Becton, Dickinson, and Co. | 382903057894 | Any 27-28 G needle |
| Gorilla Epoxy | Gorilla | 4200101 | |
| Kwik-CAST | World Precision Instruments | KWIK-CAST |
References
- Duan, M. I., Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).
- Kelso, C. M., et al. Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane. Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).
- Salt, A. N., Plontke, S. K. Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications. Hear Res. 368, 28-40 (2018).
- Szeto, B., et al. Inner ear delivery: Challenges and opportunities. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).
- Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. Ultrastructural studies of the human round window membrane. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).
- Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. Microtechnologies for inner ear drug delivery. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).
- Leong, S., et al. Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs. Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).
- Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105 (2022).
- Du, X., et al. Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs. Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).
- Kopke, R. D., et al. Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant. Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).
- AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. AVMA. , (2020).
- Goksu, N., et al. Anatomy of the guinea pig temporal bone. Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).
- Wysocki, J. Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone. Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).
- Veit, J. G. S., et al. An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes. Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037 (2022).
- Kansara, V., Mitra, A. K. Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery). Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).
- Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).
- Moatti, A., et al. Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model. iScience. 26 (6), 106789 (2023).
- Lin, Y. C., et al. Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane. Front Pharmacol. 12, 689032 (2021).
- Jeong, S. H., et al. Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL. Int J Mol Sci. 22 (18), 10061 (2021).
