Marsvin Membranexplantation med runda fönster för Ex Vivo-studier

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för explantation av det runda fönstermembranet från marsvins tinningben, vilket ger en värdefull resurs för ex vivo-studier .

Abstract

Effektiv och minimalt invasiv läkemedelstillförsel till innerörat är en stor utmaning. Det runda fönstermembranet (RWM), som är en av de få ingångarna till innerörat, har blivit ett viktigt fokus för forskning. På grund av komplexiteten i att isolera RWM är dock vår förståelse av dess farmakokinetik fortfarande begränsad. RWM består av tre distinkta lager: det yttre epitelet, det mellersta bindvävsskiktet och det inre epitelskiktet, som var och en potentiellt har unika leveransegenskaper.

Nuvarande modeller för att undersöka transport över RWM använder in vivo-djurmodeller eller ex vivo RWM-modeller som bygger på cellkulturer eller membranfragment. Marsvin fungerar som en validerad preklinisk modell för undersökning av läkemedelsfarmakokinetik i innerörat och är en viktig djurmodell för translationell utveckling av bärare till cochlean. I den här studien beskriver vi ett tillvägagångssätt för explantation av ett marsvin RWM med omgivande cochleaben för läkemedelstillförselexperiment. Denna metod gör det möjligt att bevara den ursprungliga RWM-arkitekturen och kan ge en mer realistisk representation av transporthinder än nuvarande stationära modeller.

Introduction

Nya klasser av terapier har dykt upp för behandling av sensorineural hörselnedsättning. Överföringen av dessa läkemedel till kliniska populationer begränsas av säkra och effektiva transportvägar till innerörat. Nuvarande metoder för in vivo-tillförsel i djurstudier bygger på antingen fenestration i innerörat eller diffusion genom det runda fönstermembranet (RWM), en icke-benös barriär som separerar mellanörats utrymme från cochlean¹.

Kirurgisk fenestrering och mikroinjektion i innerörat är båda invasiva och kan innebära risker för kvarvarande innerörats funktion². Därför är RWM en viktig väg för lokal läkemedelstillförsel, och marsvin är den primära prekliniska djurmodellen som används för att studera lokal läkemedelsfarmakokinetik över RWM och i innerörat för läkemedelsutveckling ^3,4. Även om marsvins-RWM är tunnare än den mänskliga RWM:n har den en identisk treskiktsstruktur. Den är cirka 1 mm i diameter, 15-25 μm tjock och består av två epitelcellskikt som ligger intill ett bindvävsskikt⁵. Epitelskiktet som vetter mot mellanörat är tätt packat och sammankopplat via täta korsningar, medan skiktet som vetter mot innerörat och scala tympani har lösare arkitektur och inte har betydande intercellulära sammanväxningar.

Aktuella prekliniska studier som undersöker läkemedelspermeabilitet hos RWM hos marsvin bygger på injektioner i mellanörat in vivo följt av provtagning av perilymfvätskan i innerörat, vilket inte möjliggör den specifika studien av RWM-transport ^6,7. Fragment av RWM-explantat har använts i prekliniska studier, men på grund av deras bräcklighet och lilla storlek är de inte lämpliga för systematiska, mikrofluidiska undersökningar av läkemedels- och fordonstransport som kräver en vattentät tätning över RWM². Andra grupper har använt in vitro-modeller med odlade humana epitelceller för att approximera RWM ^8,9,10. Majoriteten av dessa konstruktioner fokuserar dock enbart på det yttre epitelskiktet och fångar inte komplexiteten i den naturliga vävnadsarkitekturen. För en mer detaljerad förståelse av transportmekanismerna i RWM krävs riktade ex vivo-studier.

I denna studie demonstrerar vi explantationen av en marsvins-RWM med omgivande benstöd för att bevara membranintegriteten och illustrerar deras användning i ett experimentellt paradigm utformat för den specifika studien av RWM-transport av läkemedelsleveransfordon.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albinomarsvin (både hanar och honor, som väger 500-700 g) användes i den aktuella studien. 1. Procedurinställning och förberedelse Sterilisera alla instrument med etylenoxid innan experimentet påbörjas. Avliva djuren i enlighet med det institutionellt godkända protokollet.OBS: I den aktuella studien användes en icke-förladdad kammare för att släpp…

Representative Results

Som visas i figur 3A gör denna metod det möjligt att explantationera det intakta runda fönstermembranet hos marsvin med en omgivande ring av styvt ben. RWM ska vara helt ansluten till den beniga ringen omkrets. Inga frakturer på cochleabenet bör uppskattas. I jämförelse med mänskliga exemplar med runda fönster har marsvin RWM inget överliggande pseudomembran. Dessutom, till skillnad från människor, finns det en benig bro mellan marsvinsstapes, vilket kräver sprickbildning och av…

Discussion

Vid lokal läkemedelstillförsel till örat är RWM den primära passagevägen för läkemedel att nå innerörat. En noggrann och tillförlitlig bänkmodell behövs för att bättre förstå transportmekanismer och permeabilitet i nya leveransfordon och för läkemedelsutveckling. I denna studie visar vi att RWM-explantation av marsvin är en genomförbar och pålitlig procedur för att möjliggöra systematiska undersökningar av läkemedels-membraninteraktioner. Lundman et al. och Kelso et al. har tidigare beskrivit a…

Materials

1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST