Marsvin Round Window Membrane Explantation for Ex vivo studier

Summary

Denne protokollen skisserer en metode for eksplantasjon av den runde vindusmembranen fra marsvin temporale bein, og gir en verdifull ressurs for ex vivo studier.

Abstract

Effektiv og minimalt invasiv legemiddellevering til det indre øret er en betydelig utfordring. Den runde vindusmembranen (RWM), som er en av de få inngangspunktene til det indre øret, har blitt et viktig fokus for undersøkelser. På grunn av kompleksiteten ved å isolere RWM, er vår forståelse av farmakokinetikken imidlertid fortsatt begrenset. RWM består av tre forskjellige lag: det ytre epitelet, det midterste bindevevslaget og det indre epitellaget, som hver potensielt har unike leveringsegenskaper.

Nåværende modeller for å undersøke transport over RWM bruker in vivo dyremodeller eller ex vivo RWM-modeller som er avhengige av cellekulturer eller membranfragmenter. Marsvin fungerer som en validert preklinisk modell for undersøkelse av farmakokinetikken i det indre øret og er en viktig dyremodell for translasjonell utvikling av leveringsbiler til cochlea. I denne studien beskriver vi en tilnærming for eksplantasjon av et marsvin RWM med omkringliggende cochleabein for benchtop-legemiddelleveringseksperimenter. Denne metoden muliggjør bevaring av opprinnelig RWM-arkitektur og kan gi en mer realistisk representasjon av transportbarrierer enn dagens stasjonære modeller.

Introduction

Nye klasser av terapeutika har dukket opp for behandling av sensorinevralt hørselstap. Oversettelsen av disse behandlingene til kliniske populasjoner er begrenset av trygge og effektive transportveier til det indre øret. Nåværende metoder for in vivo levering i dyrestudier er avhengig av enten fenestrasjon i det indre øret eller diffusjon gjennom den runde vindusmembranen (RWM), en ikke-osseøs barriere som skiller mellomøret fra cochlea¹.

Både kirurgisk fenestrasjon og mikroinjeksjon i det indre øret er invasivt og kan utgjøre en risiko for gjenværende indre ørefunksjon². Derfor er RWM en viktig rute for lokal legemiddellevering, og marsvin er den primære prekliniske dyremodellen som brukes til å studere lokal legemiddelfarmakokinetikk over RWM og i det indre øret for farmasøytisk utvikling ^3,4. Selv om den er tynnere enn den menneskelige RWM, deler marsvinet RWM en identisk trelags struktur. Den er ca. 1 mm i diameter, 15-25 μm tykk, og består av to epitelcellelag som sandwicher et bindevevslag⁵. Epitellaget mot mellomøret er tettpakket og forbundet via tette kryss, mens laget mot det indre øret og scala tympani har løsere arkitektur og har ikke signifikante intercellulære adhesjoner.

Nåværende prekliniske studier som undersøker legemiddelpermeabilitet hos marsvin RWM, er avhengige av in vivo mellomøreinjeksjoner etterfulgt av prøvetaking av perilymfevæsken i det indre øret, noe som ikke tillater den spesifikke studien av RWM-transport ^6,7. Fragmenter av RWM-eksplanter har blitt brukt i prekliniske studier, men på grunn av deres skjørhet og lille størrelse er de ikke egnet for systematiske, mikrofluidiske undersøkelser av legemiddel- og kjøretøytransport som krever en vanntett forsegling over RWM². Andre grupper har benyttet in vitro-modeller med dyrkede humane epitelceller for å tilnærme RWM ^8,9,10. Imidlertid fokuserer flertallet av disse konstruksjonene utelukkende på det ytre epitellaget og fanger ikke kompleksiteten til innfødt vevsarkitektur. For en mer detaljert forståelse av transportmekanismer på tvers av RWM er det nødvendig med målrettede ex vivo-studier.

I denne studien demonstrerer vi eksplantasjonen av en marsvin RWM med omkringliggende benstøtte for å bevare membranintegritet og illustrere bruken av dem i et eksperimentelt paradigme designet for den spesifikke studien av RWM-transport av legemiddelleveringsbiler.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226). Hartley albino marsvin (både hann og kvinne, veier 500-700 g) ble brukt i denne studien. 1. Prosedyreoppsett og forberedelse Steriliser alle instrumenter med etylenoksid før du begynner forsøket. Avlive dyrene etter den institusjonelt godkjente protokollen.MERK: I den nåværende studien ble et ikke-forhåndsladet kammer ansatt for å frigjøre 100% karbondiok…

Representative Results

Som vist i figur 3A, tillater denne metoden eksplantasjon av den intakte marsvin runde vindusmembranen med en omkringliggende ring av stivt bein. RWM skal være fullt koblet til den benete ringrommet omkretsende. Ingen brudd i cochleabenet bør verdsettes. I sammenligning med menneskelige runde vindusprøver har marsvin RWM ikke en overliggende pseudomembran. I tillegg, i motsetning til mennesker, er det en benete bro mellom crura av marsvinstiftene, som krever oppsprekking og fjerning før …

Discussion

I lokal legemiddellevering til øret er RWM den primære passasjeveien for terapeutika for å nå det indre øret. En nøyaktig og pålitelig stasjonær modell er nødvendig for å bedre forstå transportmekanismer og permeabilitet på tvers av nye leveringskjøretøy og for legemiddelutvikling. I denne studien demonstrerer vi at marsvin RWM-eksplantasjon er en gjennomførbar og pålitelig prosedyre for å tillate systematiske undersøkelser av legemiddelmembraninteraksjoner. Lundman et al. og Kelso et al. har tidligere …

Materials

1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co.	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST