تطوير مقايسات RT-qPCR متعددة الإرسال في الوقت الحقيقي للكشف عن SARS-CoV-2 وأنفلونزا A / B و MERS-CoV
Summary
نقدم مجموعتين داخليتين من RT-qPCR بخطوة واحدة قائمة على المسبار لفيروسات الجهاز التنفسي الشائعة. الفحص الأول هو ل SARS-CoV-2 (N) ، والإنفلونزا A (H1N1 و H3N2) ، والإنفلونزا B. والثاني هو ل SARS-Cov-2 (N) و MERS (UpE و ORF1a). يمكن تنفيذ هذه المقايسات بنجاح في أي مختبر متخصص.
Abstract
يشكل فيروس كورونا 2 المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) المسبب لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) تهديدا خطيرا لصحة عامة الناس. خلال مواسم الأنفلونزا ، قد يتسبب انتشار SARS-CoV-2 وفيروسات الجهاز التنفسي الأخرى في عبء أمراض الجهاز التنفسي على مستوى السكان يصعب إدارته. لذلك، ستحتاج فيروسات الجهاز التنفسي SARS-CoV-2 والإنفلونزا A والإنفلونزا B ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS-CoV) إلى مراقبة دقيقة في فصلي الخريف والشتاء المقبلين، لا سيما في حالة SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B، التي تشترك في عوامل وبائية مماثلة مثل السكان المعرضين للإصابة وطريقة الانتقال والمتلازمات السريرية. بدون مقايسات محددة الهدف ، قد يكون من الصعب التمييز بين حالات هذه الفيروسات بسبب أوجه التشابه بينها. وفقا لذلك ، فإن مقايسة تعدد الإرسال الحساسة والمستهدفة التي يمكن أن تفرق بسهولة بين هذه الأهداف الفيروسية ستكون مفيدة لممارسي الرعاية الصحية. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير اختبار قائم على النسخ العكسي في الوقت الفعلي باستخدام مجموعة R3T بخطوة واحدة RT-qPCR المطورة داخليا للكشف المتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV. مع ما لا يقل عن 10 نسخ من الحمض النووي الريبي الاصطناعي ، يمكننا تحديد أهداف SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV بنجاح في وقت واحد بدقة 100٪. تم العثور على هذا الفحص ليكون دقيقا وموثوقا وبسيطا وحساسا ومحددا. يمكن استخدام الطريقة المطورة كاختبار تشخيصي محسن ل SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV في المستشفيات والمراكز الطبية ومختبرات التشخيص وكذلك لأغراض البحث.
Introduction
تنجم جائحة مرض فيروس كورونا المستمر 2019 (COVID-19) عن فيروس كورونا الجديد المعروف باسم فيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (SARS-CoV-2) 1. نظرا للعدوى القوية ل SAR-CoV-2 وقدرتها على الانتقال السريع ، ظهر جائحة COVID-19 في مدينة ووهان ، الصين ، وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم. أدى هذا في النهاية إلى ظهور علامات الضائقة التنفسية وحتى الموت2،3،4. تم إعلان COVID-19 جائحة في أكثر من 213 دولة ، متوقعا زيادة حادة في عدد الحالات المؤكدة ، كما يتضح من الأوراق المنشورة في دراسات بحثية مختلفة 3,5. ينتقل COVID-19 بشكل أساسي عن طريق قطرات الجهاز التنفسي الصغيرة التي يطلقها الأفراد المصابون في البيئة ثم يتعرضون للأفراد الضعفاء من خلال الاستنشاق أو الاتصال الوثيق بالأسطح الملوثة. عندما تتلامس هذه القطرات مع الغشاء المخاطي للعينين أو الفم أو الأنف ، قد يصاب الشخصبالعدوى 6. تظهر الإحصاءات الصادرة عن منظمة الصحة العالمية (WHO) أن هناك أكثر من 76 مليون حالة مؤكدة للوباء في جميع أنحاء العالم ، مع 7 ملايين حالة وفاةمذهلة 7. وهكذا، صنفت الأمم المتحدة الوباء الناجم عن مرض كوفيد-19 على أنه كارثة بسبب تأثيره المباشر على حياة مليارات الأشخاص حول العالم وكان له آثار اقتصادية وبيئية واجتماعية بعيدة المدى.
وقد ثبت أن مبادرات الصحة العمومية، بما في ذلك الاختبار الشامل، والكشف المبكر، وتتبع المخالطين، وعزل الحالات حاسمة في إبقاء هذا الوباء تحت السيطرة8،9،10،11. ستزيد أشهر الشتاء من تداول فيروسات الجهاز التنفسي الأخرى مثل الأنفلونزا A و B مع أعراض تشبه COVID-19 مما يجعل من الصعب تحديد حالات COVID-19 وتعقبها وعزلها في وقت مبكر. كل عام ، يبدأ تفشي الأنفلونزا A و B في أواخر الخريف أو أوائل يناير مع موسمية يمكن التنبؤ بها12. تشترك فيروسات SARS-CoV-2 وفيروسات الأنفلونزا في العديد من السمات الوبائية. إلى جانب ذلك ، تقاسم أوجه التشابه في السكان المعرضين للإصابة والتي تشمل الأطفال وكبار السن ونقص المناعة والأفراد الذين يعانون من أمراض مصاحبة مزمنة مثل الربو أو مرض الانسداد الرئوي المزمن أو الفشل القلبي والكلوي أو مرض السكري12,13. ولا تشترك هذه الفيروسات في الفئات السكانية الضعيفة فحسب، بل تشترك أيضا في طرق انتقال الاتصال والرذاذ التنفسي14. من المتوقع أن يصاب المرضى على الأرجح بأكثر من واحد من فيروسات الجهاز التنفسي هذه مع اقتراب موسم الأنفلونزا14. لذلك ، يجب إجراء فحص SARS-CoV-2 وفيروسات الأنفلونزا على المرضى الذين تظهر عليهم الأعراض قبل عزلهم. لا يمكن إجراء اختبارات منفصلة للفيروسات الثلاثة (SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B) بسبب النقص العالمي في الموارد اللازمة لاستخراج الحمض النووي وتشخيصه. من أجل فحصها جميعا في تفاعل واحد ، يجب تطوير طريقة أو اختبار.
متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) -CoV هي أحد أفراد عائلة فيروس كورونا البشري (CoV). وجاءت أولى حالات عزل فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية من مريض أدخل المستشفى في المملكة العربية السعودية وتوفي في أيلول/ سبتمبر 2012 بسبب مشاكل تنفسيةحادة15. وهناك بينات تشير إلى أن الجمال العربية هي موطن المستودع البارز لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. لقد ثبت أن الفيروسات من الجمال العربية المصابة هي حيوانية المنشأ وبالتالي يمكن أن تصيب البشر16,17. يمكن للبشر المصابين بهذا الفيروس أن ينشروه للآخرين من خلال الاتصال الوثيق18. وحتى 26 كانون الثاني/يناير 2018، كانت هناك 2143 حالة مؤكدة مختبريا للإصابة بعدوى فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية، بما في ذلك 750 حالة وفاة على مستوىالعالم 19 حالة. والأعراض الأكثر شيوعا للإصابة بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية هي السعال والحمى وضيق التنفس. كما أبلغ عن ظهور أعراض الالتهاب الرئوي والإسهال وأمراض الجهاز الهضمي20 عدوى بفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. ولا يتوفر حاليا لقاح تجاري أو علاج محدد لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. ولذلك، فإن التشخيص الفوري والدقيق ضروري للوقاية من فاشيات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية على نطاق واسع والتمييز بين فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ومرض كورونا-سارس-2.
حتى الآن ، تم اقتراح العديد من الأساليب للكشف عن هذه الفيروسات مثل تعدد الإرسال RT-PCR21،22،23،24،25 ، CRISPR / Cas1226،27 ، CRISPR / Cas928 ، و CRISPR / Cas329 ، المقايسة المناعية للتدفق الجانبي30 ، المستشعرات الجزيئية الحيويةالورقية 31 ، اختبار شيرلوك في وعاء واحد32 ، أبتامير الحمض النووي33 ، متساوي الحرارة بوساطة الحلقة التضخيم (LAMP) 19،34 ، إلخ. كل طريقة من الطرق المذكورة أعلاه لها مزايا وعيوب فريدة من حيث الحساسية والخصوصية. من بين هذه الطرق ، الاختبار القائم على تضخيم الحمض النووي: متعدد الإرسال qRT-PCR ، هو الأكثر شيوعا ويعتبر المعيار الذهبي لتشخيص SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و MERS-CoV.
في هذه الدراسة ، قمنا بتصميم وتقييم مجموعات وتحقيقات أولية مختلفة للكشف الفعال والدقيق والمتزامن عن SARS-CoV-2 و Influenza A و Influenza B و SARS-CoV-2 و MERS-CoV باستخدام الحمض النووي الريبي الفيروسي الاصطناعي الملتوي القياسي. وتوصي منظمة الصحة العالمية بإجراء المقايسات المتعددة الإرسال التي وضعت إما للجينات المستهدفة لفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية أو لفيروس كورونا-سارس-2. وتشفر هذه الجينات عموما البروتينات والمعقدات التي تسهم في تكوين مركب النسخ المتماثل/النسخ (RTC)35 مثل المنطقة داخل إطار القراءة المفتوح 1a (ORF1a) المستخدم في مقايسة فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تشفير البروتينات الهيكلية بواسطة الجينات المستخدمة في المقايسات التشخيصية مثل منطقة المنبع لجين المغلف (upE) وجين nucleocapsid (N) اللذين يستخدمان في مقايسات فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية و SARS-Cov-2 ، على التوالي35,36. استخدمنا مجموعة R3T الداخلية ذات الخطوة الواحدة RT-qPCR لإنشاء RT-qPCR للكشف عن الفيروسات37. تم اختبار وتقييم الكشف عن الفيروسات والحساسية والنوعية والنطاق الديناميكي لمجموعة R3T RT-qPCR ذات الخطوة الواحدة ومجموعات التمهيدي باستخدام التخفيفات التسلسلية 10 أضعاف للحمض النووي الريبي الاصطناعي الملتوي القياسي. كان أدنى حد للكشف العملي حوالي 10 نسخ نسخ لكل تفاعل. ونتيجة لذلك، يمكن استخدام مجموعة R3T RT-qPCR الداخلية ذات الخطوة الواحدة ومجموعات التمهيدي/المسبار وتنفيذها بنجاح من أجل التشخيص المتزامن الروتيني لفيروس كورونا-سارس-2 والأنفلونزا A والأنفلونزا B وفيروس كورونا-سارس-2 وفيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عبء اقتصادي ثقيل على نظام الرعاية الصحية في جميع أنحاء العالم ناتج عن ارتفاع معدلات العدوى والوفيات بسبب انتشار فيروسات الجهاز التنفسي الشائعة مثل SARS-CoV-2 و Influenza A / B ومتغيرات MERS-CoV12،19،20. بدافع من الشعور بالمسؤولية تجاه تخفيف هذا العب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية من خلال التمويل الأساسي والتحدي الوطني الكبير (NTGC) ل SMH.
Materials
| 0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
| 6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
| Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
| FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
| Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
| Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
| Protein marker | Fermentas | 26616 | |
| RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
| Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
- Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
- Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
- Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
- Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
- El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
- . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
- Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
- Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
- Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
- Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
- Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
- Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
- Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
- Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
- Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
- Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
- Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
- Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
- Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
- Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
- Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
- Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
- Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
- Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
- Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
- Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
- Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
- Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
- Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
- Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
- Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
- Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
- McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
- AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
- Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
- Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
- Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
- Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
- van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
- Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
- Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
- Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
- Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
- Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).
