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Biology

SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B, और MERS-CoV का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स रीयल-टाइम RT-qPCR परख का विकास

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

हम आम श्वसन वायरस के लिए दो जांच-आधारित इन-हाउस वन-स्टेप RT-qPCR किट पेश करते हैं। पहली परख SARS-CoV-2 (N), इन्फ्लुएंजा A (H1N1 और H3N2), और इन्फ्लुएंजा B के लिए है। दूसरा SARS-Cov-2 (N) और MERS (UpE और ORF1a) के लिए है। इन परखों को किसी भी विशेष प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है।

Abstract

गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2) जो कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) का कारण बनता है, आम जनता के स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा है। इन्फ्लूएंजा के मौसम के दौरान, SARS-CoV-2 और अन्य श्वसन वायरस के प्रसार से श्वसन रोग का जनसंख्या-व्यापी बोझ हो सकता है जिसे प्रबंधित करना मुश्किल है। उसके लिए, श्वसन वायरस SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम (MERS-CoV) को आगामी गिरावट और सर्दियों के मौसम में सावधानी से देखने की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा ए और इन्फ्लुएंजा बी के मामले में, जो अतिसंवेदनशील आबादी, संचरण के तरीके और नैदानिक सिंड्रोम जैसे समान महामारी विज्ञान कारकों को साझा करते हैं। लक्ष्य-विशिष्ट परख के बिना, इन वायरस के मामलों में उनकी समानता के कारण अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। तदनुसार, एक संवेदनशील और लक्षित मल्टीप्लेक्स परख जो आसानी से इन वायरल लक्ष्यों के बीच अंतर कर सकती है, स्वास्थ्य चिकित्सकों के लिए उपयोगी होगी। इस अध्ययन में, हमने SARS-CoV-3, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV का एक साथ पता लगाने के लिए इन-हाउस विकसित R2T वन-स्टेप RT-qPCR किट का उपयोग करके एक रीयल-टाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस-PCR-आधारित परख विकसित की। उनके सिंथेटिक आरएनए की कम से कम 10 प्रतियों के साथ, हम 100% विशिष्टता के साथ एक साथ SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और MERS-CoV लक्ष्यों की सफलतापूर्वक पहचान कर सकते हैं। यह परख सटीक, विश्वसनीय, सरल, संवेदनशील और विशिष्ट पाया जाता है। विकसित विधि का उपयोग अस्पतालों, चिकित्सा केंद्रों और नैदानिक प्रयोगशालाओं के साथ-साथ अनुसंधान उद्देश्यों के लिए एक अनुकूलित SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV नैदानिक परख के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

चल रहे कोरोनावायरस रोग 2019 (COVID-19) की महामारी गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (SARS-CoV-2)1 के रूप में जानी जाने वाली नॉवल कोरोनावायरस के कारण होती है। SAR-CoV-2 की मजबूत संक्रामकता और तेजी से संचरण की क्षमता के कारण, COVID-19 महामारी वुहान शहर, चीन में उभरी और दुनिया भर में तेजी से फैल गई। यह अंततः श्वसन संकट के संकेतों और यहां तक कि मृत्यु 2,3,4 की शुरुआत का कारण बना। COVID-19 को 213 से अधिक देशों में एक महामारी घोषित किया गया है, पुष्टि किए गए मामलों की संख्या में भारी वृद्धि की उम्मीद है, जैसा कि विभिन्न शोध अध्ययनों 3,5 द्वारा प्रकाशित पत्रों से स्पष्ट है। COVID-19 मुख्य रूप से छोटी श्वसन बूंदों द्वारा प्रेषित होता है जो संक्रमित व्यक्ति पर्यावरण में छोड़ते हैं और फिर दूषित सतहों के साथ साँस लेने या निकट संपर्क के माध्यम से कमजोर व्यक्तियों के संपर्क में आते हैं। जब ये बूंदें आंखों, मुंह या नाक के म्यूकोसा के संपर्क में आती हैं, तो एक व्यक्ति संक्रमित हो सकताहै। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा जारी आंकड़े बताते हैं कि दुनिया भर में महामारी के 76 मिलियन से अधिक पुष्ट मामले सामने आए हैं, जिसमें 7 मिलियन मौतें हुईहैं। इस प्रकार, संयुक्त राष्ट्र ने COVID-19 रोग के कारण होने वाली महामारी को एक आपदा के रूप में वर्गीकृत किया क्योंकि इसका दुनिया भर के अरबों लोगों के जीवन पर सीधा प्रभाव पड़ा और इसके दूरगामी आर्थिक, पर्यावरणीय और सामाजिक प्रभाव पड़े।

पूरी तरह से परीक्षण, प्रारंभिक पहचान, संपर्क अनुरेखण और मामले के अलगाव सहित सार्वजनिक स्वास्थ्य पहलों को इस महामारी को नियंत्रण में रखने में महत्वपूर्ण दिखाया गयाहै 8,9,10,11. सर्दियों के महीनों में इन्फ्लुएंजा ए और बी जैसे अन्य श्वसन वायरस के प्रसार में वृद्धि होगी, जिसमें COVID-19 जैसे लक्षण होंगे, जिससे COVID-19 मामलों को पहचानना, ट्रैक करना और अलग करना मुश्किल हो जाएगा। हर साल, इन्फ्लुएंजा ए और बी का प्रकोप देर से गिरने या जनवरी की शुरुआत में अनुमानित मौसमी12 के साथ शुरू होता है। SARS-CoV-2 और इन्फ्लुएंजा वायरस द्वारा कई महामारी विज्ञान लक्षण साझा किए जाते हैं। इसके अलावा, अतिसंवेदनशील आबादी में समानताएं साझा करना जिसमें बच्चे, बुजुर्ग, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड और अस्थमा, क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज, कार्डियक और रीनल फेल्योर, या डायबिटीज12,13 जैसे क्रोनिक कॉमरेडिटी वाले व्यक्ति शामिल हैं। ये वायरस न केवल कमजोर आबादी को साझा करते हैं बल्कि संपर्क और श्वसन बूंदों के संचरण मार्गों को भी साझाकरते हैं। यह अनुमान लगाया गया है कि फ्लू के मौसममें 14 के करीब पहुंचने पर रोगियों को इनमें से एक से अधिक श्वसन वायरस की संभावना हो सकती है। इसके लिए, SARS-CoV-2 और इन्फ्लुएंजा वायरस की जांच रोगसूचक रोगियों पर अलग-थलग करने से पहले की जानी चाहिए। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और निदान के लिए संसाधनों की वैश्विक कमी के कारण तीन वायरस (SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, और इन्फ्लुएंजा B) के लिए अलग-अलग परीक्षण चलाना संभव नहीं है। उन सभी को एक प्रतिक्रिया में स्क्रीन करने के लिए, एक विधि या परीक्षण विकसित करने की आवश्यकता है।

मिडिल ईस्ट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम (MERS)-CoV एक मानव कोरोनावायरस (CoV) परिवार का सदस्य है। पहला MERS-CoV वायरस आइसोलेट्स सऊदी अरब में एक अस्पताल में भर्ती मरीज से आया था, जिसकी सितंबर 2012 में तीव्र श्वसन समस्याओंके कारण मृत्यु हो गई थी। ऐसे सबूत हैं जो बताते हैं कि MERS-CoV के लिए एक प्रमुख जलाशय मेजबान ड्रोमेडरी ऊंट है। यह साबित हो गया है कि संक्रमित ड्रोमेडरी ऊंटों से वायरस जूनोटिक हैं और इस प्रकार मनुष्योंको 16,17 संक्रमित कर सकते हैं। इस वायरस से संक्रमित मनुष्य निकट संपर्क18 के माध्यम से दूसरों को यह फैल सकता है. 26जनवरी, 2018 तक, MERS-CoV संक्रमण के 2143 प्रयोगशाला-पुष्ट मामले सामने आए थे,जिनमें विश्व स्तर पर 750 मौतें शामिल थीं। सबसे विशिष्ट MERS-CoV लक्षण खांसी, बुखार और सांस की तकलीफ हैं। MERS-CoV संक्रमण भी निमोनिया, दस्त और जठरांत्र संबंधी बीमारीके लक्षण 20 प्रदर्शित करने के लिए सूचित किया गया है. वर्तमान में, MERS-CoV के लिए कोई व्यावसायिक टीका या विशिष्ट उपचार उपलब्ध नहीं है। इसलिए, व्यापक MERS-CoV के प्रकोप को रोकने और MERS-CoV को SARS-CoV-2 रोग से अलग करने के लिए शीघ्र और सटीक निदान आवश्यक है।

आज तक, इन वायरस का पता लगाने के लिए कई दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं जैसे मल्टीप्लेक्स आरटी-पीसीआर 21,22,23,24,25, सीआरआईएसपीआर/सीएएस 1226,27, सीआरआईएसपीआर / कैस 928, और सीआरआईएसपीआर / कैस 329, पार्श्व प्रवाह इम्यूनोसे30, पेपर-आधारित बायोमोलेक्यूलर सेंसर31, एक पॉट32 में शेरलॉक परीक्षण, डीएनए एपटामर 33, लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (दीपक)19,34, आदि। उपरोक्त विधियों में से प्रत्येक में संवेदनशीलता और विशिष्टता के संदर्भ में अद्वितीय लाभ और कमियां हैं। इन विधियों में, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन-आधारित परीक्षण: मल्टीप्लेक्स qRT-PCR, सबसे आम है और इसे SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B और MERS-CoV के निदान के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है।

इस अध्ययन में, हमने मानक ट्विस्ट सिंथेटिक वायरल आरएनए का उपयोग करके SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV के प्रभावी, सटीक और एक साथ पता लगाने के लिए विभिन्न प्राइमर संयोजनों और जांचों का डिज़ाइन और मूल्यांकन किया। MERS-CoV या SARS-CoV-2 लक्ष्य जीन के लिए विकसित मल्टीप्लेक्स assays की सिफारिश विश्व स्वास्थ्य संगठन (WHO) द्वारा की जाती है। ये जीन आम तौर पर प्रोटीन और कॉम्प्लेक्स को एन्कोड करते हैं जो प्रतिकृति/प्रतिलेखन परिसर (RTC)35 के निर्माण में योगदान करते हैं जैसे कि खुले रीडिंग फ्रेम 1a (ORF1a) के भीतर का क्षेत्र जिसका उपयोग MERS-CoV परख के लिए किया जाता है। इसके अलावा, संरचनात्मक प्रोटीन नैदानिक परख में उपयोग किए जाने वाले जीन द्वारा एन्कोड किए जाते हैं जैसे कि लिफाफा जीन (यूपीई) और न्यूक्लियोकैप्सिड जीन (एन) के अपस्ट्रीम क्षेत्र जो एमईआरएस-सीओवी और एसएआरएस-सीओवी -2 परख के लिए उपयोग किए जाते हैं, क्रमशः35,36। हमने वायरस37 का पता लगाने के लिए RT-qPCR स्थापित करने के लिए इन-हाउस R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट का उपयोग किया। वायरस का पता लगाने, संवेदनशीलता, विशिष्टता, और हमारे R3T एक कदम RT-qPCR किट और प्राइमर सेट की गतिशील रेंज परीक्षण और मानक मोड़ सिंथेटिक RNAs के 10 गुना धारावाहिक dilutions का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया. सबसे कम व्यावहारिक पहचान सीमा प्रति प्रतिक्रिया लगभग 10 प्रतिलेख प्रतियां थी। नतीजतन, इन-हाउस R3T वन-स्टेप RT-qPCR किट और प्राइमर/प्रोब सेट को SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A, इन्फ्लुएंजा B, और SARS-CoV-2, MERS-CoV के नियमित एक साथ निदान के लिए सफलतापूर्वक उपयोग और कार्यान्वित किया जा सकता है।

Protocol

1. Taq पोलीमरेज़ अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण एंजाइम के सी-टर्मिनस पर एक दरार हेक्सा-हिस्टिडाइन टैग के साथ एक प्लाज्मिड का निर्माण करें। मानक प्रोटोकॉल38 के बाद ई कोलाई BL21- (DE3) तनाव में ?…

Representative Results

हाल के वर्षों में, पीसीआर दृष्टिकोण 21,22,23,24,25का उपयोग करके सामान्य श्वसन वायरस का पता लगाने के लिए नैदानिक दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण प्रगति ह?…

Discussion

SARS-CoV-2, इन्फ्लुएंजा A/B और MERS-CoV वेरिएंट 12,19,20 जैसे सामान्य श्वसन वायरस के प्रसार के कारण उच्च संक्रमण और मृत्यु दर के परिणामस्वरूप दुनिया भर में स्वास्थ्य सेवा प्रणाली पर भ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी द्वारा कोर फंडिंग और एसएमएच को नेशनल टर्म ग्रैंड चैलेंज (एनटीजीसी) के माध्यम से समर्थित किया गया था।

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
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References

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Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
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