JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Utveckling av multiplexa realtids-RT-qPCR-analyser för detektion av SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65822
, , , , , ,
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE),King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Summary

Vi presenterar två probbaserade enstegs RT-qPCR-kit för vanliga luftvägsvirus. Den första analysen är för SARS-CoV-2 (N), influensa A (H1N1 och H3N2) och influensa B. Den andra är för SARS-Cov-2 (N) och MERS (UpE och ORF1a). Dessa analyser kan framgångsrikt implementeras i alla specialiserade laboratorier.

Abstract

Det svåra akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som orsakar Coronavirus disease 2019 (COVID-19) är ett allvarligt hot mot allmänhetens hälsa. Under influensasäsonger kan spridningen av SARS-CoV-2 och andra luftvägsvirus orsaka en befolkningsomfattande börda av luftvägssjukdomar som är svår att hantera. För det kommer luftvägsvirusen SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) att behöva övervakas noggrant under de kommande höst- och vintersäsongerna, särskilt när det gäller SARS-CoV-2, influensa A och influensa B, som delar liknande epidemiologiska faktorer som mottagliga populationer, överföringssätt och kliniska syndrom. Utan målspecifika analyser kan det vara svårt att skilja mellan fall av dessa virus på grund av deras likheter. Följaktligen kommer en känslig och riktad multiplexanalys som enkelt kan skilja mellan dessa virala mål att vara användbar för vårdpersonal. I denna studie utvecklade vi en realtidsanalys av omvänt transkriptas-PCR med hjälp av ett egenutvecklat R3T enstegs RT-qPCR-kit för samtidig detektion av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV. Med så få som 10 kopior av deras syntetiska RNA kan vi framgångsrikt identifiera SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och MERS-CoV-mål samtidigt med 100 % specificitet. Denna analys visar sig vara korrekt, pålitlig, enkel, känslig och specifik. Den utvecklade metoden kan användas som en optimerad SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostisk analys på sjukhus, medicinska centra och diagnostiska laboratorier samt för forskningsändamål.

Introduction

Pandemin av den pågående coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) orsakas av det nya coronaviruset som kallas severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. På grund av SAR-CoV-2:s starka smittsamhet och förmåga till snabb överföring uppstod covid-19-pandemin i staden Wuhan i Kina och spred sig snabbt över hela världen. Detta ledde så småningom till att man började få tecken på andnöd och till och med dödsfall 2,3,4. Covid-19 har förklarats vara en pandemi i mer än 213 länder, vilket tyder på en kraftig ökning av antalet bekräftade fall, vilket framgår av de artiklar som publicerats i olika forskningsstudier 3,5. COVID-19 överförs främst genom små luftvägsdroppar som infekterade individer släpper ut i miljön och sedan exponeras för sårbara individer genom inandning eller nära kontakt med kontaminerade ytor. När dessa droppar kommer i kontakt med slemhinnan i ögon, mun eller näsa kan en person bli infekterad6. Statistik från Världshälsoorganisationen (WHO) visar att det har funnits mer än 76 miljoner bekräftade fall av pandemin över hela världen, med häpnadsväckande 7 miljoner dödsfall7. Således klassificerade FN pandemin orsakad av COVID-19-sjukdomen som en katastrof på grund av dess direkta inverkan på livet för miljarder människor runt om i världen och hade långtgående ekonomiska, miljömässiga och sociala effekter.

Folkhälsoinitiativ som grundlig testning, tidig upptäckt, kontaktspårning och fallisolering har alla visat sig vara avgörande för att hålla denna pandemi under kontroll 8,9,10,11. Vintermånaderna kommer att öka cirkulationen av andra luftvägsvirus som influensa A och B med covid-19-liknande symtom som gör det svårt att identifiera, spåra och isolera covid-19-fall tidigt. Varje år börjar utbrott av influensa A och B i slutet av hösten eller början av januari med en förutsägbar säsongsvariation12. Många epidemiologiska egenskaper delas av SARS-CoV-2 och influensavirus. Dessutom delar likheter i de mottagliga populationerna som inkluderar barn, äldre, immunsupprimerade och individer med kroniska komorbiditeter som astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, hjärt- och njursvikt eller diabetes12,13. Dessa virus delar inte bara sårbara populationer utan även smittvägar för kontakt och droppsmitta14. Det förväntas att patienter sannolikt kan drabbas av mer än ett av dessa luftvägsvirus när influensasäsongen närmar sig14. För det måste screening av SARS-CoV-2 och influensavirus göras på symtomatiska patienter innan de isoleras. Att köra separata tester för de tre virusen (SARS-CoV-2, influensa A och influensa B) är inte möjligt på grund av den globala bristen på resurser för nukleinsyraextraktion och diagnostik. För att screena dem alla i en reaktion behöver en metod eller ett test utvecklas.

Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV är en familjemedlem till humant coronavirus (CoV). De första isolaten av MERS-CoV-viruset kom från en patient som var inlagd på sjukhus i Saudiarabien och som hade avlidit i september 2012 på grund av akutaandningsproblem. Det finns bevis som tyder på att en framträdande reservoarvärd för MERS-CoV är dromedarer. Det har bevisats att virus från infekterade dromedarer är zoonotiska och därmed kan infektera människor16,17. Människor som är infekterade med detta virus kan sprida det till andra genom nära kontakt18. Fram till den 26 januari 2018 hade det förekommit 2143 laboratoriebekräftade fall av MERS-CoV-infektion inklusive 750 dödsfall globalt19. De mest typiska MERS-CoV-symtomen är hosta, feber och andnöd. MERS-CoV-infektioner har också rapporterats uppvisa symtom på lunginflammation, diarré och gastrointestinala sjukdomar20. För närvarande finns inget kommersiellt vaccin eller specifik behandling för MERS-CoV tillgängligt. Därför är snabb och exakt diagnos avgörande för att förhindra de utbredda MERS-CoV-utbrotten och skilja MERS-CoV från SARS-CoV-2-sjukdomen.

Hittills har många metoder föreslagits för att detektera dessa virus, t.ex. multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 och CRISPR/Cas329, lateral flow immunoassay30, pappersbaserade biomolekylära sensorer31, SHERLOCK-testning i en kruka 32, DNA-aptamer33, loopmedierad isoterm förstärkning (LAMPA)19,34, etc. Var och en av de ovan nämnda metoderna har unika fördelar och nackdelar när det gäller känslighet och specificitet. Bland dessa metoder är det nukleinsyraamplifieringsbaserade testet: multiplex qRT-PCR, det vanligaste och anses vara guldstandarden för diagnos av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och MERS-CoV.

I denna studie designade och utvärderade vi olika primerkombinationer och sonder för effektiv, exakt och samtidig detektion av SARS-CoV-2, Influensa A, Influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV med hjälp av standard twist syntetiska virala RNA. De multiplexade analyserna som utvecklats för antingen MERS-CoV- eller SARS-CoV-2-målgener rekommenderas av Världshälsoorganisationen (WHO). Dessa gener kodar i allmänhet för proteiner och komplex som bidrar till bildandet av ett replikations-/transkriptionskomplex (RTC)35, såsom regionen inom den öppna läsramen 1a (ORF1a) som används för MERS-CoV-analys. Dessutom kodas strukturella proteiner av de gener som används i diagnostiska analyser, t.ex. uppströmsregionen av höljegenen (upE) och nukleokapsidgenen (N) som används för MERS-CoV- och SARS-Cov-2-analyser, respektive35,36. Vi använde vårt interna R3T-kit i ett steg RT-qPCR-kit för att etablera RT-qPCR för detektering av virus37. Virusdetektion, känslighet, specificitet och dynamiskt omfång för vårt R3T enstegs RT-qPCR-kit och primer-set testades och utvärderades med hjälp av 10-faldiga serieutspädningar av de syntetiska standard-RNA:erna. Den lägsta praktiska detektionsgränsen var cirka 10 transkriptkopior per reaktion. Som ett resultat kan det interna R3T-enstegs RT-qPCR-kitet och primer-/sonduppsättningarna framgångsrikt användas och implementeras för rutinmässig samtidig diagnos av SARS-CoV-2, influensa A, influensa B och SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Protocol

1. Taq-polymerasuttryck och rening Konstruera en plasmid med en klyvbar hexa-histidintagg vid enzymets C-terminal. Transformera 50 ng av expressionsvektorn till E. coli BL21-(DE3) stam enligt standardprotokollet38. Inokulera de transformerade cellerna i fyra 6-literskolvar som var och en innehåller 2 liter 2 liter 2-litersbuljong vid 37 °C med skakning vid 170 varv per minut tills OD 600 på 0,8 eller cellnummer 6,4 x 108 uppnås…

Representative Results

Under de senaste åren har det skett betydande framsteg i den diagnostiska metoden för att upptäcka vanliga luftvägsvirus med hjälp av PCR-metoder 21,22,23,24,25. Men trots dessa framsteg har den multiplexade metoden, som gör det möjligt att upptäcka flera virus i ett enda test, inte implementerats i någon större utsträckning, särskilt inte i RT-qPC…

Discussion

Hälso- och sjukvårdssystemet i hela världen har en tung ekonomisk börda till följd av de höga infektions- och dödstalen på grund av spridningen av vanliga luftvägsvirus som SARS-CoV-2, influensa A/B och MERS-CoV-varianterna 12,19,20. Motiverade av ansvarskänslan för att lindra denna börda insåg vi behovet av en snabb, exakt och tillgänglig diagnostisk analys som RT-qPCR för att skilja mellan dessa vanliga virus i …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av King Abdullah University of Science and Technology genom kärnfinansiering och National Term Grand Challenge (NTGC) till S.M.H.

Materials

0.45 μm filter cups Thermo Scientific 291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer Novex LC2675
6-well tissue culturing plates Corning 353046
Ammonium sulfate Fisher Scientific A701-3
Ampicillin Corning 61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL Cytiva 17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+% Thermo Scientific A14207.60
DH10Bac competent cells Fisher Scientific 10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) Thermo Scientific 68100
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water Ambion AM9930
dNTPs Thermo Scientific R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells Invitrogen C600003
EDTA Fisher Scientific BP120-1
Elution Buffer Qiagen 19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) Expression Systems 96-001-01
FBS Solution Gibco A38400-01
Fugene (transfection reagent) Promega E2311
Gentamicin Fisher Scientific 15750060
Glycerol Sigma Aldrich G5516-500
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I8896-100ml
Imidazole Sigma Aldrich 56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA Twist Bioscience 103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA Twist Bioscience 103002
Influenza B synthetic RNA Twist Bioscience 103003
IPTG Gold Biotechnology I3481C100
Kanamycin Gibco 11815-032
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth media Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-10G
Magnesium Chloride Sigma Aldrich 13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA Twist Bioscience 103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1093
Miniprep kit Qiagen 27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL Cytiva 17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL Cytiva 17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free Applied Biosystems 4311971
Potassium Chloride Fisher Bioreagents BP366-1
Primers and Probes Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free Thermo Scientific A32955
Protein marker Fermentas 26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) Applied Biosystems
S.O.C medium Fisher Scientific 15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA Twist Bioscience 102024
Sf9 insect cells Gibco A35243
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL Cytiva 29401323
Tetracycline IBI Scientific IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade Promega H5135
Tris-HCl Affymetrix 22676
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-100ml
X-Gal Invitrogen B1690
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450 (2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1 (2022).
  7. . WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard Available from: https://covid19.who.int (2023)
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3 (2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101 (2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335 (2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960 (2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867 (2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295 (2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328 (2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129 (2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830 (2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042 (2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412 (2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151 (2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634 (2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Tags

SARS-CoV-2Influenza AInfluenza BMERS-CoVMultiplex Real-time RT-qPCRRespiratory VirusesIn-house Developed R3T One-step RT-qPCR KitDiagnostic AssaySimultaneous DetectionSensitivitySpecificity
check_url/65822?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Althobaiti, A., Hamdan, K., Sobhy, M. A., Rawas, R., Takahashi, M., Artyukh, O., Tehseen, M. Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV. J. Vis. Exp. (201), e65822, doi:10.3791/65822 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image