Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.
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Artículo de método
Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV
En este artículo
Resumen
Resumen
El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una grave amenaza para la salud pública en general. Durante las temporadas de influenza, la propagación del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios puede causar una carga de enfermedades respiratorias en toda la población que es difícil de manejar. Para ello, los virus respiratorios SARS-CoV-2, gripe A, gripe B y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) deberán vigilarse cuidadosamente en las próximas temporadas de otoño e invierno, especialmente en el caso del SARS-CoV-2, la gripe A y la gripe B, que comparten factores epidemiológicos similares como las poblaciones susceptibles, el modo de transmisión y los síndromes clínicos. Sin ensayos específicos de objetivos, puede ser difícil diferenciar entre los casos de estos virus debido a sus similitudes. En consecuencia, un ensayo múltiple sensible y dirigido que pueda diferenciar fácilmente entre estas dianas virales será útil para los profesionales sanitarios. En este estudio, desarrollamos un ensayo basado en PCR con transcriptasa inversa en tiempo real utilizando un kit de RT-qPCR de un solo paso R3T desarrollado internamente para la detección simultánea de SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con tan solo 10 copias de sus ARN sintéticos, podemos identificar con éxito los objetivos del SARS-CoV-2, la gripe A, la gripe B y el MERS-CoV simultáneamente con un 100% de especificidad. Se ha comprobado que este ensayo es preciso, fiable, sencillo, sensible y específico. El método desarrollado se puede utilizar como un ensayo de diagnóstico optimizado para SARS-CoV-2, influenza A, influenza B y SARS-CoV-2, MERS-CoV en hospitales, centros médicos y laboratorios de diagnóstico, así como con fines de investigación.
Introducción
La pandemia de la actual enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) está causada por el nuevo coronavirus conocido como coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2)1. Debido a la fuerte contagiosidad del SAR-CoV-2 y a su capacidad de transmisión rápida, la pandemia de COVID-19 surgió en la ciudad de Wuhan, China, y se propagó rápidamente por todo el mundo. Con el tiempo, esto condujo al inicio de signos de dificultad respiratoria e incluso a la muerte 2,3,4. La COVID-19 ha sido declarada pandemia en más de 213 países, previéndose un....
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Protocolo
1. Expresión y purificación de la polimerasa Taq
- Construya un plásmido con una etiqueta de hexa-histidina escindible en el extremo C de la enzima.
- Transformar 50 ng del vector de expresión en cepa BL21-(DE3) de E. coli siguiendo el protocolo estándar38.
- Inocular las células transformadas en cuatro matraces de 6 L, cada uno de los cuales contiene 2 L de caldo de 2YT a 37 °C con agitación a 170 rpm hasta alcanzar el OD 600 de 0,8 o el número de celda 6,4 x 108 .
- Inducir la expresión de la polimerasa Taq con 0,5 mM de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) e incubar a ....
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Resultados
En los últimos años, se han producido avances significativos en el abordaje diagnóstico para la detección de virus respiratorios comunes mediante abordajes de PCR 21,22,23,24,25. Sin embargo, a pesar de estos avances, el enfoque multiplexado, que permite detectar múltiples virus en una sola prueba, no se ha implementado ampliamente, particularmente en la plata.......
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Discusión
Existe una pesada carga económica para el sistema de salud en todo el mundo como resultado de las altas tasas de infección y mortalidad debido a la propagación de virus respiratorios comunes como el SARS-CoV-2, la influenza A/B y las variantes del MERS-CoV 12,19,20. Motivados por el sentido de responsabilidad para aliviar esta carga, nos dimos cuenta de la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido, preciso y accesible, como l.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah a través de fondos básicos y el National Term Grand Challenge (NTGC) a S.M.H.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ Copas de filtro m | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tampón de funcionamiento Tris-Glycine SDS | Novex | LC2675 | |
| Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Corning | 353046 | |
| Sulfato de amonio | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicilina | Corning | 61-238-RH | |
| Intercambio catiónico (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotina, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac células competentes | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Bolsa de diálisis (Snakeskin 10.000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Dthiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Dnase/RNASA Agua destilada libre | Ambion | AM9930 | |
| dNTPs | Thermo Scientific | R0192< | |
| em>E. coli BL21(DE3) células competentes | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Tampón de elución | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 medio de cultivo de células de insectos (medios de células de insectos) | Sistemas | de expresión96-001-01 | |
| FBS Solución | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (reactivo de transfección) | Promega | E2311 | |
| Gentamicina | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glicerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazol | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) ARN sintético | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) ARN sintético | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B ARN sintético | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Medios de caldo | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lisozima | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Cloruro de magnesio | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV ARN sintético | Twist Bioscience | 103015 | |
| MicroAmp Fast Optical Placas de reacción de 96 pocillos con código de barras (0,1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Mini- PROTEAN TGX Gel prefabricado | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Cubiertas de adhesión óptica (compatible con PCR, inhibidores de ADN/ARNasa/PCR | Biosystems de aplicación | 4311971 | |
| cloruro de potasio | Fisher Bioreactivos | BP366-1 | |
| cebadores y sondas | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
| Inhibidor de la proteasa Mini comprimidos Sin EDTA | Thermo Scientific | A32955 | |
| Marcador de proteínas | Fermentas | 26616 | |
| Máquina RT-qPCR (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medio | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 ARN sintético | Twist Bioscience | 102024 | |
| Células de insectos Sf9 | Gibco | A35243 | |
| Cloruro de Sodio | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetraciclina | IBI Scientific IB02200 | ||
| Tris Base Biología Molecular Grado Promega | H5135 | ||
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
Referencias
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
- Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
- Huang, C., <....
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Reimpresiones y permisos
