Her presenterer vi en protokoll for å studere frekvensen av programmert celledødsinitiering ved kontinuerlig avbildning av inokulerte blader etter celledødsinduksjon.
Oversensitiv respons (HR)-gitt resistens er en effektiv forsvarsrespons som kan bestemmes av N-resistensgenene. HR manifesteres som dannelsen av celledødssoner på inokulerte blader. Her presenteres en protokoll for å studere frekvensen av celledødsinitiering ved å avbilde inokulerte blader i tiden mellom celledødsinitiering og celledødsutseendet ved hjelp av et digitalt mikroskop. Det digitale mikroskopet muliggjør en kontinuerlig avbildningsprosess i ønskede intervaller, noe som muliggjør en nøyaktig bestemmelse av initieringshastighet for celledød opp til minutter nøyaktig, i motsetning til timer i tradisjonelle metoder. Avbildning med det digitale mikroskopet er også uavhengig av lys og kan derfor brukes dag og natt uten å forstyrre plantens døgnrytme. Ulike patosystemer som resulterer i programmert celledødsutvikling kan studeres ved hjelp av denne protokollen med mindre modifikasjoner. Samlet sett tillater protokollen dermed enkel, nøyaktig og billig identifisering av initieringsrate for celledød.
Potet er en av verdens mest dyrkede matvekster, fjerdeplass bak ris, hvete og mais. Potetproduksjonen kan imidlertid bli sterkt påvirket av potetvirus Y (PVY), som i dag regnes som det viktigste viruspatogenet 1,2. I potetplanter cv. Rywal, flere stammer av PVY (inkludert PVY-stamme N-Wilga) utløser overfølsom respons (HR)-overdratt resistens, hvor patogenets begrensning til infeksjonsstedet manifesterer seg som nekrotiske lesjoner på inokulerte blader3. I dette patosystemet medieres HR av Ny-1-resistensgen, som er temperaturavhengig, da planter dyrket ved lavere temperaturer effektivt utvikler nekrotiske lesjoner, mens i planter dyrket konstitutivt ved forhøyet (28 °C) temperatur er abort av resistens demonstrert som mangel på lesjonsdannelse og systemisk virusspredning 3,4. Når plantene overføres til en lavere temperatur (22 °C), initieres celledød, som kan utnyttes til å følge frekvensen av celledødsinitiering ved å avbilde inokulerte blader i tiden mellom celledødsinitiering og celledød.
Denne protokollen demonstrerer en enkel metode for bestemmelse av initieringshastighet for celledød ved hjelp av et digitalt mikroskop. Ved å avbilde de inokulerte bladene etter overføring fra 28 °C til 22 °C, muliggjør et digitalt mikroskop kontinuerlig observasjon av bladet i ønskede intervaller. I motsetning til bruken av andre metoder (for eksempel konfokalmikroskopi eller observasjon av lesjonsdannelse med det blotte øye), tillater dette bestemmelse av den nøyaktige tiden for lesjonsdannelse og derfor celledødsinitieringshastigheten opp til minutter nøyaktig, i motsetning til timer i de nevnte metodene 5,6. Bruk av digitalt mikroskop er også uavhengig av lys og kan derfor brukes både dag og natt. Denne protokollen kan også brukes til å identifisere komponenter involvert i initiering av celledød eller for å bestemme effekten av forskjellige komponenter på initieringshastigheten for celledød hvis brukte planter er transgene og har endrede nivåer av komponenter av interesse.
Den demonstrerte protokollen lar brukeren nøyaktig bestemme initieringshastigheten for celledød ved kontinuerlig å avbilde inokulerte blader i tiden mellom celledødsinitiering og celledødsutseende ved hjelp av et digitalt mikroskop. Selv om det er mange måter å overvåke lesjon og forekomst av plantesykdommerpå 12,13,14,15, presenterer denne protokollen fordelen med lysuavhengig måling uten å forstyrre plantens døgnrytme, da lyset slås av mellom målingene.
Etter inokuleringen skal plantene vokse ved 28 °C i 3 dager. Ny-1-resistensgenet , som induserer en overfølsom respons, er temperaturavhengig, og i planter dyrket ved høyere temperaturer fører det til abort av resistens, noe som manifesteres som mangel på lesjonsdannelse og systemisk virusspredning3. Etter at plantene er overført til 22 °C, startes celledød, så for nøyaktige resultater bør observasjon med et digitalt mikroskop starte så snart som mulig etter denne overføringen. Et annet viktig skritt i forberedelsen av planten for avbildning er immobiliseringen av bladet (figur 1D), da planten vil fortsette å vokse under avbildning, noe som kan flytte det observerte bladet ut av fokus, eller et slikt oppsett vil ikke gi ønskede resultater.
Hvis den beskrevne protokollen brukes på transgene planter med endrede komponenter av interesse, antatt å være involvert i initiering av celledød, gjør protokollen det mulig for brukeren å avgjøre om det reduserte nivået av en studert komponent påvirker frekvensen av celledødsinitiering. Ved det kan komponenter involvert i celledødsinitiering identifiseres i patosystemer, hvor programmert celledød oppstår, ved hjelp av denne protokollen. Andre metoder for å identifisere disse komponentene er for eksempel transkriptomisk analyse som RNA-seq eller ulike former for mikroskopi, som kan være kostbart og tidkrevende16. Metoden beskrevet i denne protokollen muliggjør enkel og billig identifisering av komponenter involvert i celledødsinitiering ved å observere forskjeller i initieringsrater for celledød mellom transgene og kontrollanlegg. Optimalt, i et slikt oppsett, må to digitale kameraer brukes, da et transgent anlegg skal analyseres parallelt med et kontrollanlegg innenfor samme eksperiment.
I denne protokollen ble PVY-stamme N-Wilga brukt; Imidlertid kan andre stammer av dette viruset, for eksempel GFP-merket PVY (PVY-N605 (123) -GFP) 7, også brukes. Videre kan andre patosystemer, som resulterer i programmert celledødsutvikling, studeres ved hjelp av denne protokollen med mindre modifikasjon.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Barbara Jaklič for teknisk assistanse. Denne forskningen ble støttet økonomisk av det slovenske forsknings- og innovasjonsbyrået (forskningskjernefinansiering nr. P4-0165 og prosjekt Z4-3217: Dekryptere redoksrelatert signaleringssammenkobling i potetresistens mot virus).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi | N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |