Denne protokollen beskriver et oppsett for krystallisering av steroltransportøren ABCG5/G8. ABCG5/G8 rekonstitueres til biceller for hengende dråpekrystallisering. Protokollen krever ikke spesialiserte materialer eller substrater, noe som gjør den tilgjengelig og enkel å tilpasse i ethvert laboratorium for å bestemme proteinstrukturen gjennom røntgenkrystallografi.
ATP-bindende kassett (ABC) transportører utgjør lipid-innebygde membranproteiner. Ekstrahering av disse membranproteinene fra lipid-dobbeltlaget til et vandig miljø oppnås vanligvis ved å bruke vaskemidler. Disse vaskemidlene desintegrerer lipid-dobbeltlaget og solubiliserer proteinene. Den inneboende habitat av membranproteiner i lipid-dobbeltlaget utgjør en utfordring for å opprettholde stabiliteten og ensartetheten i løsningen for strukturell karakterisering. Biceller, som består av en blanding av lange og kortkjedede fosfolipider og vaskemidler, replikerer den naturlige lipidstrukturen. Utnyttelsen av lipidbiceller og vaskemidler tjener som et egnet modellsystem for å oppnå diffraksjonskrystaller av høy kvalitet, spesielt for å bestemme membranproteinets høyoppløselige struktur. Gjennom disse syntetiske mikromiljøene bevarer membranproteiner sin opprinnelige konformasjon og funksjonalitet, noe som letter dannelsen av tredimensjonale krystaller. I denne tilnærmingen ble den vaskemiddelløselige heterodimere ABCG5/G8 reintegrert i DMPC/CHAPSO-biceller, supplert med kolesterol. Dette oppsettet ble ansatt i dampdiffusjonseksperimentell prosedyre for proteinkrystallisering.
ATP-bindende kassett (ABC) transportører utgjør en superfamilie av membranproteiner som er ansvarlige for ulike ATP-avhengige transportprosesser over biologiske membraner 1,2,3,4,5. Disse transportørproteinene er involvert i kardiovaskulære sykdommer og spiller en viktig rolle i å lette kolesterolutstrømningen til gallen for påfølgende utskillelse i leveren. Følgelig har kolesterolmetabolisme og balanse fått betydelig interesse gjennom årene6. En spesifikk mekanisme involvert i eliminering av kolesterol og andre steroler fra kroppen involverer medlemmer av den menneskelige ABCG-underfamilien, spesielt den heterodimere ABCG5 / G8 7,8,9,10. Mutasjoner i et av disse genene forstyrrer heterodimeren, noe som fører til tap av funksjon og forårsaker sitosterolememi, en lidelse som påvirker sterolhandel11,12,13. Gitt sykdommens relevans og deres rolle i å fremme kolesterolutstrømning, har steroltransportører tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet. Likevel forblir de intrikate detaljene i deres molekylære mekanisme og substratselektivitet stort sett ukjent. Dermed er belysningen av krystallstrukturen til ABCG5 / G8 et avgjørende skritt mot å forstå mekanismene og nedstrømsfunksjonene i kolesteroltransport.
Membranproteiner krever forankring i membraner for å folde seg og fungere riktig. Følgelig resulterer ekstrahering av membranproteiner fra deres naturlige miljø ofte i proteinustabilitet, feilfolding og tap av funksjon14,15. Disse utfordringene understreker de primære hindringene som står overfor i membranproteinkrystallisering. Imidlertid har rekonstituering av proteiner i syntetiske vaskemiddel-dobbeltlag, som biceller, dukket opp som en løsning på denne vanskeligheten, noe som muliggjør vedlikehold av membranproteiner i et innfødt-lignende dobbeltlagsmiljø16. Biceller er samlinger av syntetiske fosfolipider og vaskemidler suspendert og oppløselig i vann. Spesielt vedtar de en tolagsstruktur som etterligner biologiske membraner16,17,18. Bicelles kan overgå mellom væske- og gelfaser basert på temperatur og viskositet. Bicellekrystallisering utnytter de små dobbeltlagsskivene og lav viskositet ved reduserte temperaturer, noe som letter grundig blanding av proteiner og bicelleløsninger. Størrelsen på bicellene avhenger av forholdet mellom vaskemiddel og lipid under forberedelse19,20. De utbredte vaskemidlene for bicelledannelse inkluderer 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-2-hydroksy-1-propansulfonat (CHAPSO), sammen med 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) og 1,2-ditridecanoyl-sn-glyserol-3-fosfokolin (DHPC)21. Disse vaskemidlene brukes sammen med lipider som di-myristoyl-fosfatidylkolin (DMPC) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-fosfatidylkolin (POPC). Videre har nyere studier vist full funksjonalitet av membranproteiner i biceller under fysiologiske forhold. For eksempel krystalliserte Lee og kolleger vellykket og rapporterte krystallstrukturen til ABCG5 / ABCG8 basert på et lipid-dobbeltlag22,23. I krystallisasjonsprosessen kan protein-bicelle-blandinger innkvarteres ved hjelp av standardutstyr, inkludert krystalliseringsroboter med høy gjennomstrømning24. Muligheten for å benytte biceller henger imidlertid på proteinets termostabilitet på grunn av krystallisasjonsforholdene ved høyere temperaturer. Likevel, sammenlignet med andre teknikker, forblir de nødvendige krystallisasjonsbetingelsene for membranproteiner generelt milde, noe som involverer lave konsentrasjoner av utfelling, salt og buffer. Dette gjør både protein-bicelle-blandinger og dampdiffusjon effektive og lett implementerbare verktøy for strukturelle studier av membranproteiner.
Denne protokollen skisserer viktige trinn i proteinpreparasjon og bicellekrystallisering for å bestemme røntgenkrystallstrukturen til ABCG5 / G8 ved høy oppløsning (figur 1).
Utfordringene knyttet til krystalliserende membranproteiner har ført til utvikling av lipid-dobbeltlagsdrevne krystallisasjonsmetoder, for eksempel bicelle27 eller lipid kubisk fase (LCP) 14 tilnærminger. Å oppnå vellykket krystallisering av membranproteiner er imidlertid fortsatt avhengig av det kritiske og noen ganger flaskehalsede trinnet med proteinpreparasjon. Spesielt presenterer ABC-transportører en formidabel hindring i voksende krystaller egnet for røntgenkrystallografi. Denne protokollen gir omfattende praktisk veiledning for å strømlinjeforme fremstillingen av human ABCG5 / G8 steroltransportør og fremme krystallvekst gjennom bicellekrystallisasjonsmetoden.
En sentral faktor ved utarbeidelsen av denne protokollen var imperativet for et betydelig proteinutbytte i de innledende fasene av proteinrensing, noe som muliggjorde en viss grad av proteintap under prekrystallisasjonsbehandling (figur 3). Vanlige strategier for å takle denne utfordringen involverer omfattende proteinteknikk, utnyttelse av ulike uttrykksverter og utforskning av ortologer eller homologer, blant andre tilnærminger. Likevel, med denne tilsynelatende intrikate prosedyren, har en rekke sentrale trinn blitt identifisert som underbygger protokollens suksess og gir også innsikt i potensielle begrensninger som kan oppstå når man studerer andre ABC-transportører eller membranproteiner generelt.
For det første bruker denne protokollen grundig sentrifugering på hvert trinn for å minimere proteinaggregering. I tillegg er kontinuerlig overvåking av termostabiliteten til de rensede proteinene avgjørende. Elektronmikroskopi brukes til å verifisere proteinmonodispersjon, mens analytisk gelfiltrering sporer proteinstabilitet over tid (figur 2). Alternative teknikker som sirkulær dikroisme (CD) eller differensialskanningskalorimetri (DSC) kan også innlemmes. Videre er inkorporering av lipider i bestemte stadier avgjørende for å maksimere både aktiviteten og krystallogenesen til den rensede ABCG5 / G8. For eksempel er kolat og CHS nødvendig for å utvise målbar ATP-hydrolyse; fosfolipider er uunnværlige for å opprettholde stabiliteten til metylerte proteiner; og kolesterol er en nødvendig komponent i bicelleløsningen, og fremmer krystallvekst egnet for høyoppløselig røntgendiffraksjon (figur 4).
I hovedsak kan hele prosedyren oppnås innen en ukes innsats. I motsetning til LCP er henting av krystaller fra krystallisasjonsbrett med hengende dråpe grei. Når vi ser fremover, med et betydelig proteinutbytte (ca. 10 mg), er denne protokollen lett tilpasningsdyktig for å utvikle krystallografiske undersøkelser som involverer ABCG5 / G8 mutanter eller andre transportørproteiner. Dette er spesielt relevant for tilfeller som i dag unndrar seg visualisering gjennom elektronmikroskopi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av et Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) og et Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) til JYL. Denne protokollen er basert på de opprinnelige rapportene i ABCG5/G8 krystallstrukturer rapportert tidligere av Farhat et al.22 og Lee et al.23.
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |