Microdissection et coloration par immunofluorescence des manchons myocardiques dans les veines pulmonaires murines
Summary
Ce protocole démontre l’isolement guidé par microscopie et la coloration par immunofluorescence des veines pulmonaires murines. Nous préparons des échantillons de tissus contenant l’oreillette gauche, les veines pulmonaires et les poumons correspondants et les colorons pour la troponine T cardiaque et la connexine 43.
Abstract
Les veines pulmonaires (PV) sont la principale source de battements ectopiques dans les arythmies auriculaires et jouent un rôle crucial dans le développement et la progression de la fibrillation auriculaire (FA). Les PV contiennent des manchons myocardiques (MS) composés de cardiomyocytes. Les SEP sont impliquées dans l’initiation et le maintien de la FA, car elles préservent les similitudes avec le myocarde cardiaque, y compris la capacité de générer des impulsions électriques ectopiques. Les rongeurs sont largement utilisés et peuvent représenter d’excellents modèles animaux pour étudier le myocarde de la veine pulmonaire puisque les cardiomyocytes sont largement présents sur toute la paroi des vaisseaux. Cependant, la microdissection et la préparation précises des PV murins sont difficiles en raison de la petite taille des organes et de l’anatomie complexe.
Nous démontrons un protocole de microdissection guidée par microscopie pour isoler l’oreillette gauche (LA) murine avec les PVs. Une coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps cardiaques à base de troponine-T (cTNT) et de connexine 43 (Cx43) est réalisée pour visualiser le LA et les PV dans leur intégralité. L’imagerie à des grossissements de 10x et 40x fournit une vue complète de la structure PV ainsi que des informations détaillées sur l’architecture myocardique, mettant en évidence en particulier la présence de connexine 43 dans la SEP.
Introduction
La fibrillation auriculaire (FA) est l’arythmie soutenue la plus fréquente1. La prévalence de la fibrillation auriculaire augmente encore avec un nombre attendu de ~17,9 millions de patients en Europe en 20601. La fibrillation auriculaire est cliniquement très importante car elle constitue un facteur de risque essentiel pour le développement d’un infarctus du myocarde, d’une insuffisance cardiaque ou d’un accident vasculaire cérébral, entraînant un énorme fardeau individuel, social et socio-économique1. Même si la fibrillation auriculaire est connue depuis des décennies, la physiopathologie de la fibrillation auriculaire n’est pas encore entièrement comprise2.
Déjà à la fin des années 1990, des études ont démontré le grand impact des veines pulmonaires (PV) dans l’initiation et le maintien de la FA, car elles sont la principale source de battements ectopiques déclenchant la FA3. Il a été démontré que les PV diffèrent structurellement des autres vaisseaux sanguins. Alors que les vaisseaux sanguins typiques contiennent des cellules musculaires lisses, la tunique moyenne des PV contient également des cardiomyocytes4. Chez les rongeurs, cette musculature cardiaque est omniprésente dans l’ensemble des PV, y compris les parties intra- et extrapulmonaires, ainsi que dans la région de l’orifice5. Chez l’homme, les PV contiennent également des cardiomyocytes, qui peuvent être observés dans les extensions du myocarde auriculaire gauche (LA), appelées manchons myocardiques (SEP)6,7.
Les SEP présentent des similitudes morphologiques avec le myocarde auriculaire8. La forme et la taille des cardiomyocytes auriculaires et PV ne varient pas significativement entre eux et présentent des propriétés électrophysiologiques comparables8. Des enregistrements électrophysiologiques à l’intérieur du PV ont prouvé l’activité électrique de la SEP, et l’imagerie angiographique a révélé des contractions synchronisées avec le rythme cardiaque 9,10.
Les jonctions lacunaires sont des complexes protéiques formant des pores composés de six sous-unités de connexine, qui permettent le passage d’ions et de petites molécules11. Des jonctions lacunaires existent dans les appositions de cellule à cellule, interconnectent les cardiomyocytes voisins et permettent un couplage électrique intercellulaire entre les cardiomyocytes12,13. Plusieurs isoformes de connexine sont exprimées dans le cœur, la connexine 43 (Cx43) étant l’isoforme la plus courante exprimée dans toutes les régions du cœur14. Des études antérieures ont mis en évidence l’expression de Cx43 dans les cardiomyocytes des PVs15,16.
Il reste difficile d’étudier la SEP dans les PV intacts en raison de leur structure délicate, en particulier dans les modèles de petits animaux. Ici, nous montrons comment identifier et isoler les PV avec les LA et les lobes pulmonaires chez la souris à l’aide de la microdissection guidée par microscopie. De plus, nous démontrons la coloration par immunofluorescence (FI) des PV pour visualiser les cardiomyocytes et leurs interconnexions au sein des PV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec ce protocole, nous partageons une méthode permettant de distinguer et d’isoler les PV du cœur de souris et d’effectuer une coloration par immunofluorescence sur ceux-ci. Après le prélèvement d’organes, le cœur et les poumons ont été déshydratés dans une solution de saccharose stérilisée, puis séparés les ventricules de l’oreillette et des lobes pulmonaires sous guidage microscopique. Ensuite, la base du cœur a été préparée pour visualiser les PV, puis les a coupées des poumons au niveau d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK ; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), le China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.), la Fondation allemande pour la recherche (DFG ; Programme de clinicien-chercheur en médecine vasculaire (PRIME), MA 2186/14-1 à P. T.), et la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
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