マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色
Summary
このプロトコルはマウスの肺静脈の顕微鏡検査導かれた隔離そしてimmunofluorescenceの汚損を示す。左心房、肺静脈、および対応する肺を含む組織サンプルを調製し、心臓トロポニンTおよびコネキシン43について染色します。
Abstract
肺静脈(PV)は、心房性不整脈における異所性拍動の主要な原因であり、心房細動(AF)の発症と進行に重要な役割を果たします。PVには、心筋細胞で構成される心筋スリーブ(MS)が含まれています。MSは、異所性電気インパルスを生成する能力など、心臓の働く心筋との類似性を維持するため、AFの開始と維持に関与しています。げっ歯類は広く使用されており、心筋細胞は血管壁全体に広く存在するため、肺静脈心筋を研究するための優れた動物モデルを表す可能性があります。しかし、マウスPVの正確なマイクロダイセクションと調製は、臓器のサイズが小さく、解剖学的構造が複雑なため、困難です。
マウスの左心房(LA)をPVとともに単離するための顕微鏡ガイド下顕微解剖プロトコルを実証します。 心臓トロポニン-T(cTNT)およびコネキシン43(Cx43)抗体を使用して免疫蛍光染色を行い、LAとPVの全長を可視化します。10倍および40倍の倍率でのイメージングは、PV構造の包括的なビューと心筋構造への詳細な洞察を提供し、特にMS内のコネキシン43の存在を強調しています。
Introduction
心房細動(AF)は、最も一般的な持続性不整脈です1。心房細動の有病率はさらに増加しており、2060年にはヨーロッパで~1,790万人の患者数が見込まれています1。心房細動は、心筋梗塞、心不全、脳卒中の発症に不可欠な危険因子であり、個人的、社会的、社会経済的に多大な負担をもたらすため、臨床的に非常に重要です1。心房細動は何十年も前から知られていますが、心房細動の病態生理学はまだ完全には理解されていません2。
すでに1990年代後半には、肺静脈(PV)が心房細動を誘発する異所性拍動の主な発生源であるため、心房細動の開始と維持に大きな影響を与えることが研究で実証されています3。PVは他の血管とは構造的に異なることが実証されています。一般的な血管には平滑筋細胞が含まれていますが、PVのチュニカ培地には心筋細胞も含まれています4。げっ歯類では、この心臓の筋肉組織は、肺内および肺外部分、ならびに開口部領域を含むPV全体に遍在する5。ヒトでは、PVには心筋細胞も含まれており、左心房(LA)の心筋、いわゆる心筋スリーブ(MS)の延長部内で観察することができます6,7。
多発性硬化症は心房心筋と形態学的に類似している8。心房とPV心筋細胞の形状とサイズは互いに有意に変化せず、同等の電気生理学的特性を示します8。PV内の電気生理学的記録はMSの電気的活動を証明し、血管造影画像は心拍と同期した収縮を明らかにしました9,10。
ギャップ結合は、6つのコネキシンサブユニットからなる細孔形成タンパク質複合体であり、イオンと低分子の通過を可能にする11。ギャップ結合は細胞間アポジションに存在し、隣接する心筋細胞を相互接続し、心筋細胞間の細胞間電気的結合を可能にする12,13。いくつかのコネキシンアイソフォームが心臓で発現しており、コネキシン43(Cx43)は心臓のすべての領域で発現する最も一般的なアイソフォームである14。以前の研究は、PVの心筋細胞におけるCx43の発現の証拠を提供します15,16。
インタクトPV内のMSは、そのデリケートな構造のため、特に小動物モデルでは依然として困難です。ここでは、顕微鏡ガイド下マイクロダイセクションを使用して、マウスのLAおよび肺葉とともにPVを同定および分離する方法を示します。さらに、PVの免疫蛍光染色を実証し、PV内の心筋細胞とその相互接続を可視化します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、マウス心臓のPVを区別して単離し、免疫蛍光染色を行う方法を共有しています。臓器摘出後、心臓と肺を滅菌したスクロース溶液で脱水し、続いて顕微鏡ガイド下で心室を心房と肺葉から分離しました。その後、心臓ベースを準備してPVを視覚化し、肺門からPVを切除しました。その後の免疫蛍光染色は、組織をO.C.T.化合物に包埋し、クライオトームで切断し、cTNTとCx43?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.)、China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.)、German Research Foundation (DFG;血管医学の臨床医科学者プログラム(PRIME)、MA 2186 / 14-1からPT)、およびコロナ財団(S199 / 10079 / 2019からSC)。
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
