Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas
Summary
Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.
Abstract
As veias pulmonares (VVPs) são a principal fonte de batimentos ectópicos nas arritmias atriais e desempenham um papel crucial no desenvolvimento e progressão da fibrilação atrial (FA). As VPs contêm mangas miocárdicas (SM) compostas por cardiomiócitos. A SM está implicada no início e manutenção da FA, pois preserva semelhanças com o miocárdio cardíaco de trabalho, incluindo a capacidade de gerar impulsos elétricos ectópicos. Os roedores são amplamente utilizados e podem representar excelentes modelos animais para o estudo do miocárdio da veia pulmonar, uma vez que os cardiomiócitos estão amplamente presentes em toda a parede do vaso. No entanto, a microdissecção precisa e a preparação de PVs murinos são desafiadoras devido ao pequeno tamanho do órgão e à intrincada anatomia.
Demonstramos um protocolo de microdissecção guiado por microscopia para isolar o átrio esquerdo (AE) murino juntamente com as VVPPs. A coloração por imunofluorescência usando anticorpos cardíacos Troponina-T (cTNT) e conexina 43 (Cx43) é realizada para visualizar o AE e as VPs em toda a extensão. A aquisição de imagens em aumentos de 10x e 40x fornece uma visão abrangente da estrutura das VVPN, bem como informações detalhadas sobre a arquitetura miocárdica, destacando particularmente a presença de conexina 43 dentro da EM.
Introduction
A fibrilação atrial (FA) é a arritmia sustentada mais comum1. A prevalência da FA está aumentando ainda mais, com um número esperado de ~17,9 milhões de pacientes na Europa em 20601. A FA é clinicamente de grande importância, pois é um fator de risco essencial para o desenvolvimento de infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca ou acidente vascular cerebral, resultando em uma enorme carga individual, social e socioeconômica1. Embora a FA seja conhecida há décadas, a fisiopatologia da FA ainda não étotalmente compreendida2.
Já no final da década de 1990, estudos demonstraram o grande impacto das veias pulmonares (VVPs) no início e manutenção da FA, pois são a principal fonte de batimentos ectópicos desencadeantes de FA3. Foi demonstrado que os PVs diferem estruturalmente de outros vasos sanguíneos. Enquanto os vasos sanguíneos típicos contêm células musculares lisas, a túnica média dos PVs também contém cardiomiócitos4. Em roedores, essa musculatura cardíaca está presente em toda a VP, incluindo as partes intra e extrapulmonares, bem como na região doorifício5. Em humanos, as VPs também contêm cardiomiócitos, que podem ser observados dentro de extensões do miocárdio do átrio esquerdo (AE), as chamadas mangas miocárdicas (SM)6,7.
A SM tem semelhanças morfológicas com o miocárdioatrial8. A forma e o tamanho dos cardiomiócitos atriais e PV não variam significativamente entre si e apresentam propriedades eletrofisiológicas comparáveis8. Registros eletrofisiológicos dentro do PV comprovaram a atividade elétrica da SM, e imagens angiográficas revelaram contrações sincronizadas com os batimentos cardíacos 9,10.
As junções comunicantes são complexos proteicos formadores de poros compostos por seis subunidades de conexinas, que permitem a passagem de íons e pequenas moléculas11. As junções comunicantes existem nas aposições célula-célula, interconectam cardiomiócitos vizinhos e permitem um acoplamento elétrico intercelular entre os cardiomiócitos12,13. Várias isoformas de conexina são expressas no coração, sendo a conexina 43 (Cx43) a isoforma mais comum expressa em todas as regiões docoração14. Estudos prévios evidenciam a expressão da Cx43 em cardiomiócitos dasVPs15,16.
Permanece um desafio investigar a EM dentro de PVs intactos devido à sua estrutura delicada, especialmente em modelos animais de pequeno porte. Aqui, demonstramos como identificar e isolar PVs juntamente com AL e lobos pulmonares em camundongos usando microdissecção guiada por microscopia. Além disso, demonstramos a coloração por imunofluorescência (IF) dos PVs para visualizar os cardiomiócitos e suas interconexões dentro dos PVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com esse protocolo, compartilhamos um método para distinguir e isolar os PVs do coração de camundongos e realizar a coloração de imunofluorescência neles. Após a retirada dos órgãos, o coração e os pulmões foram desidratados em solução de sacarose esterilizada, seguindo-se a separação dos ventrículos do átrio e dos lobos pulmonares sob orientação microscópica. Em seguida, a base do coração foi preparada para visualizar as VVPP e cortá-las dos pulmões no hilo. A coloração subsequente por imunofl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), pelo China Scholarship Council (CSC201808130158 a R.X.), pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; Programa de Cientista Clínico em Medicina Vascular (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), e a Fundação Corona (S199/10079/2019 a S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
