Microdisección y tinción con inmunofluorescencia de mangas miocárdicas en venas pulmonares murinas
Summary
Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.
Abstract
Las venas pulmonares (VP) son la principal fuente de latidos ectópicos en las arritmias auriculares y desempeñan un papel crucial en el desarrollo y la progresión de la fibrilación auricular (FA). Los VP contienen mangas miocárdicas (EM) compuestas por cardiomiocitos. Los SM están implicados en el inicio y mantenimiento de la FA, ya que conservan similitudes con el miocardio cardíaco que funciona, incluida la capacidad de generar impulsos eléctricos ectópicos. Los roedores son ampliamente utilizados y pueden representar excelentes modelos animales para estudiar el miocardio de la vena pulmonar, ya que los cardiomiocitos están ampliamente presentes en toda la pared del vaso. Sin embargo, la microdisección y preparación precisas de las VP murinas es un reto debido al pequeño tamaño de los órganos y a la intrincada anatomía.
Demostramos un protocolo de microdisección guiada por microscopía para aislar la aurícula izquierda murina (AI) junto con los VPs. Se realiza una tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos cardíacos contra la troponina-T (cTNT) y la conexina 43 (Cx43) para visualizar los AL y los VPs en toda su longitud. Las imágenes con aumentos de 10x y 40x proporcionan una visión completa de la estructura de la VP, así como información detallada sobre la arquitectura miocárdica, destacando especialmente la presencia de la conexina 43 dentro de la EM.
Introduction
La fibrilación auricular (FA) es la arritmia sostenida más frecuente1. La prevalencia de la FA está aumentando aún más, con un número esperado de ~17,9 millones de pacientes en Europa en 20601. La FA es clínicamente muy importante, ya que es un factor de riesgo esencial para el desarrollo de infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca o accidente cerebrovascular, lo que resulta en una enorme carga individual, social y socioeconómica1. A pesar de que la FA se conoce desde hace décadas, la fisiopatología de la FA aún no se comprende completamente2.
Ya a finales de la década de 1990, los estudios demostraron el gran impacto de las venas pulmonares (VP) en el inicio y mantenimiento de la FA, ya que son la principal fuente de latidos ectópicos desencadenantes de la FA3. Se ha demostrado que los VP difieren estructuralmente de otros vasos sanguíneos. Mientras que los vasos sanguíneos típicos contienen células musculares lisas, la túnica media de los PV también contiene cardiomiocitos4. En los roedores, esta musculatura cardíaca está presente de forma ubicua en toda la VP, incluidas las partes intra y extrapulmonares, así como en la región del orificio5. En los seres humanos, los VP también contienen cardiomiocitos, que pueden observarse dentro de las extensiones del miocardio de la aurícula izquierda (AI), las llamadas mangas miocárdicas (EM)6,7.
Los SM tienen similitudes morfológicas con el miocardio auricular8. La forma y el tamaño de los cardiomiocitos auriculares y PV no varían significativamente entre sí y muestran propiedades electrofisiológicas comparables8. Los registros electrofisiológicos dentro de la VP han demostrado la actividad eléctrica del SM y las imágenes angiográficas han revelado contracciones sincronizadas con los latidos del corazón 9,10.
Las uniones gap son complejos proteicos formadores de poros compuestos por seis subunidades de conexina, que permiten el paso de iones y moléculas pequeñas11. Existen uniones gap en las aposiciones de célula a célula, interconectan cardiomiocitos vecinos y permiten un acoplamiento eléctrico intercelular entre cardiomiocitos 12,13. Varias isoformas de conexina se expresan en el corazón, siendo la conexina 43 (Cx43) la isoforma más común expresada en todas las regiones del corazón14. Estudios previos proporcionan evidencias de la expresión de Cx43 en cardiomiocitos de los PVs15,16.
Sigue siendo un reto investigar la EM dentro de las VP intactas debido a su delicada estructura, especialmente en modelos animales pequeños. Aquí, demostramos cómo identificar y aislar los PV junto con los lóbulos pulmonares y de LA en ratones mediante microdisección guiada por microscopía. Además, demostramos la tinción por inmunofluorescencia (IF) de los PV para visualizar los cardiomiocitos y sus interconexiones dentro de los PV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con este protocolo, compartimos un método para distinguir y aislar las VPs del corazón del ratón y realizar tinciones de inmunofluorescencia sobre ellas. Después de la extracción de órganos, el corazón y los pulmones se deshidrataron en una solución de sacarosa esterilizada, seguida de la separación de los ventrículos de la aurícula y los lóbulos pulmonares bajo guía microscópica. Posteriormente, se preparó la base del corazón para visualizar los VP y luego se cortaron de los pulmones en el hilio. La post…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo del Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X3600221 a H.V., 81X2600255 a S.C.), el Consejo de Becas de China (CSC201808130158 a R.X.), la Fundación Alemana de Investigación (DFG; Programa de Científicos Clínicos en Medicina Vascular (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), y la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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