Mikrodissektion och immunofluorescensfärgning av myokardhylsor i murina lungvener
Summary
Detta protokoll visar mikroskopstyrd isolering och immunofluorescensfärgning av murina lungvener. Vi förbereder vävnadsprover som innehåller vänster förmak, lungvener och motsvarande lungor och färgar dem för hjärttroponin T och Connexin 43.
Abstract
Lungvener (PV) är den största källan till ektopiska slag vid förmaksarytmier och spelar en avgörande roll i utvecklingen och progressionen av förmaksflimmer (AF). PV innehåller myokardhylsor (MS) som består av kardiomyocyter. MS är inblandade i initiering och underhåll av AF, eftersom de bevarar likheter med hjärtarbetande myokardiet, inklusive förmågan att generera ektopiska elektriska impulser. Gnagare används i stor utsträckning och kan utgöra utmärkta djurmodeller för att studera lungvenens myokardium eftersom kardiomyocyter finns i stor utsträckning över hela kärlväggen. Exakt mikrodissektion och beredning av murina PV är dock utmanande på grund av den lilla organstorleken och den intrikata anatomin.
Vi demonstrerar ett mikroskopistyrt mikrodissektionsprotokoll för att isolera murint vänster förmak (LA) tillsammans med PV. Immunofluorescensfärgning med hjälp av hjärt-Troponin-T (cTNT) och connexin 43 (Cx43) antikroppar utförs för att visualisera LA och PV i full längd. Bildbehandling vid 10x och 40x förstoring ger en heltäckande bild av PV-strukturen samt detaljerade insikter i myokardarkitekturen, särskilt genom att belysa förekomsten av connexin 43 inom MS.
Introduction
Förmaksflimmer (AF) är den vanligaste ihållande arytmin1. Prevalensen av förmaksflimmer ökar ytterligare med ett förväntat antal på ~17,9 miljoner patienter i Europa år 20601. Förmaksflimmer är kliniskt mycket viktigt eftersom det är en viktig riskfaktor för utveckling av hjärtinfarkt, hjärtsvikt eller stroke, vilket resulterar i en enorm individuell, social och socioekonomisk börda1. Trots att förmaksflimmer har varit känt i årtionden är patofysiologin bakom förmaksflimmer fortfarande intehelt klarlagd.
Redan i slutet av 1990-talet visade studier den stora effekten av lungvener (PV) för att initiera och upprätthålla AF, eftersom de är den huvudsakliga källan till AF-utlösande ektopiska slag3. Det har visat sig att PV strukturellt skiljer sig från andra blodkärl. Medan typiska blodkärl innehåller glatta muskelceller, innehåller PV:s tunica media också kardiomyocyter4. Hos gnagare är denna hjärtmuskulatur allestädes närvarande i hela PV, inklusive intra- och extrapulmonella delar, såväl som öppningsområdet5. Hos människa innehåller PV också kardiomyocyter, som kan observeras i förlängningar av vänster förmak (LA) myokardium, så kallade myokardhylsor (MS)6,7.
MS har morfologiska likheter med förmaksmyokardiet8. Formen och storleken på förmaks- och PV-kardiomyocyter varierar inte signifikant mellan varandra och uppvisar jämförbara elektrofysiologiska egenskaper8. Elektrofysiologiska registreringar i PV har bevisat den elektriska aktiviteten hos MS, och angiografisk avbildning har avslöjat sammandragningar synkroniserade med hjärtslagen 9,10.
Gap junctions är porbildande proteinkomplex som består av sex connexin-subenheter, som tillåter passage av joner och små molekyler11. Gap-övergångar finns i cell-till-cell-appositionerna, kopplar samman närliggande kardiomyocyter och möjliggör en intercellulär elektrisk koppling mellan kardiomyocyter12,13. Flera konnexinisoformer uttrycks i hjärtat med connexin 43 (Cx43) som den vanligaste isoformen som uttrycks i alla regioner i hjärtat14. Tidigare studier ger belägg för uttrycket av Cx43 i kardiomyocyter av PV15,16.
Det är fortfarande utmanande att undersöka MS i intakta PV på grund av deras känsliga struktur, särskilt i smådjursmodeller. Här visar vi hur man kan identifiera och isolera PV tillsammans med LA och lunglober hos möss med hjälp av mikroskopistyrd mikrodissektion. Dessutom demonstrerar vi immunofluorescens (IF) färgning av PV för att visualisera kardiomyocyter och deras sammankopplingar inom PVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med detta protokoll delar vi en metod för att särskilja och isolera PV i mushjärtat och utföra immunofluorescensfärgning på dem. Efter organskörden dehydrerades hjärtat och lungorna i steriliserad sackaroslösning, följt av att kamrarna separerades från förmaken och lungloberna under mikroskopisk ledning. Efteråt förbereddes hjärtbasen för att visualisera PV:erna följt av att skära av dem från lungorna vid hilum. Den efterföljande immunofluorescensfärgningen utfördes med hjälp av en kryoteknik genom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X3600221 till H.V., 81X2600255 till S.C.), China Scholarship Council (CSC201808130158 till R.X.), den tyska forskningsstiftelsen (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 till P. T.), och Corona Foundation (S199/10079/2019 till S. C.).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
